微生物來源CpG免疫增強劑篩選與動物安全試驗

劉艷環，李海濤，朱言柱，常彤，肖家美，苗利光

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

特異性免疫是含有病原相關分子模式（PAMP）的反應物與天然免疫細胞上的模式識別受體（PRR）相結合，激活天然免疫應答，從而活化抗感染途徑的過程[1]。高度純化的新型疫苗因缺少PAMP成分，不能被天然免疫細胞的PRR很好地識別，不足以產生引起免疫應答的有效信號。CPG-DNA作為佐劑可以克服新型疫苗PAMP不足的缺陷，通過模擬感染過程誘導強烈的免疫應答[2]。本項研究為篩選適合亞單位疫苗免疫的CpG佐劑，通過淋巴細胞增殖試驗篩選出對羊、小鼠淋巴細胞都有較強細胞增殖作用的序列，為CpG佐劑的研制與應用提供理論依據.

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序為核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotides，ODN）和自然界中細菌、病毒、無脊椎動物等低等生物的基因組DNA。長期以來，DNA被認為只具有較弱的免疫原性，難以引起機體強烈的免疫反應。雖然早在1965年Braw等發現，用寡聚脫氧核苷酸與綿羊紅細胞一起注射小鼠，可明顯提高小鼠對綿羊紅細胞的免疫應答水平，并首先提出寡聚脫氧核苷酸具有免疫佐劑的觀點。但是，DNA的免疫調節作用被廣泛認識和重視是在20年后，人們研究結果表明，DNA是刺激免疫反應的重要成分之一，特別是具有特定序列的細菌 DNA或經化學修飾的DNA能刺激機體產生極為強烈的免疫應答。這類DNA可以導致一些免疫細胞的增殖和分化，具有重要的免疫調節作用。1984年，Tokunaga等[3]報道了牛分支結核桿菌（Mycobactetium Bouis，BCG）提取物中的DNA片段可增強NK細胞的活性，具有抗腫瘤效應。

本試驗通過淋巴細胞增殖試驗，篩選出對羊、小鼠淋巴細胞都具有較強細胞增殖作用的序列，并進行相應的動物安全性試驗，為進一步開展CpG免疫增強劑免疫效力試驗奠定了基礎。

1 試驗材料、儀器與試劑

1.1 試驗儀器

厭氧手套培養箱（美國Forma Scientific公司），825A厭氧罐（沈陽第五人民醫院），高速冷凍離心機ST-21（美國 Sorvall公司），96孔細胞培養板（Greiner公司）。

1.2 化學試劑[4，5，6]

限制性內切酶 EcoR1、Marker 2 000（Promega公司），EY培養基、營養肉湯培養基、TE緩沖液、質粒提取液、RPMI1640、胎牛血清（HyClone公司），淋巴細胞分離液（中國醫學科學院血液研究所）。

1.3 試驗動物

體重為16g～20g昆明小白鼠52只，雌、雄各半，購于長春生物制品研究所。

1.4 試驗材料

1.4.1 非致病性微生物來源 CpG-DNA的設計與合成 根據CpG-DNA特性，從非致病性的4種食品釀造菌〔枯草芽孢桿菌、乳酸菌（gi：16124244）、黃色短桿菌、雙歧桿菌〕基因組中找出27條CpG-DNA序列（見表1），由北京華大中生科技發展有限公司合成，聚丙烯酰氨凝膠電泳純化，純度＞99%，不含有脂多糖和內毒素。

1.4.2 致病性微生物來源 CpG-DNA的篩選 從節瘤擬桿菌、壞死梭桿菌基因組中找出5條富含CpGDNA的序列，分別命名為 CFNCpG1、CFNCpG2、CFNCpG3、CFNCpG4、Cp6。序列如下：

表1 CpG-DNA序列Tab.1 CpG-DNA Sequence

2 方法

2.1 含CpG-DNA序列質粒菌株的培養與質粒提取以及CpG-DNA序列片段的回收

將菌株接種于含Amp的LB液體培養基，37℃搖床培養24h。用堿裂解法提取質粒，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，鑒定提取結果；用EcoRI酶切質粒，1%低熔點膠回收目的片段。

2.2 淋巴細胞增殖實驗

2.2.1 羊、小鼠淋巴細胞分離 羊頸靜脈、小鼠去眼球無菌采血，肝素鈉抗凝。取抗凝血1份，與Hank’s液1∶1混勻后，加于1份細胞于分離液面之上；1500r/min離心10min；收集界面上的細胞，放入含Hank’s液4mL試管中，充分混勻；1500r/min，離心10min；吸去上清液，沉淀洗滌2次；用無血清的RPMI-1640培養液懸浮細胞，取少量于鏡下檢查分離效果。

2.2.2 淋巴細胞增殖實驗 細胞計數后，用RPMI-1640培養液將淋巴細胞稀釋為1 106個/mL。將稀釋好的淋巴細胞加入96孔培養板中，每孔加100細胞懸液。每孔加入1001640完全培養基。加入終濃度為15的CpG，同時設空白對照，混勻。37℃溫箱中培養48h。細胞計數。

2.3 CpG-DNA及CpG-DNA安全性實驗

免疫試驗前將淋巴細胞增殖試驗選出的CpG進行動物安全性試驗，保證CpG實際應用時的安全。

2.3.1 質量控制 主要檢測有無細菌、真菌等病原物質。

2.3.2 異常毒性試驗 試驗組昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射20CpG；陰性對照組昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射相同劑量的生理鹽水，觀察1周。

2.3.4 亞急性毒性試驗 按給藥方式將實驗動物分為低劑量、中劑量、高劑量3個組及1個對照組，每組10只小鼠，雌、雄各半。3個劑量組分別于雙側后肢脛前肌肌肉注射CpG-DNA只，對照組給無菌生理鹽水。每周2次，連續4周，共給藥8次，每次注射體積均為以上各組于末次給藥后24h摘眼球放血，處死。試驗期間每日觀察小鼠的外表特征和行為活動、神經癥狀、呼吸癥狀、糞便性狀等，并每周測1次體重，小鼠處死后進行病理學檢查。

3 試驗結果

3.1 淋巴細胞增殖反應

表2 CpG序列對淋巴細胞增殖效應Tab.2 The effect of CpG sequence on lymphocyte proliferation

3.2 CpG-DNA及CpG-DNA安全性試驗

3.2.1 質量控制 以無菌生理鹽水稀釋合成的CpGDNA及提取的質粒和酶切回收的CpG-DNA，未檢出細菌、真菌等病原體。

3.2.2 CpG異常毒性實驗 實驗期內所有動物均未出現異常反應，實驗結束后所有昆明小鼠全部健存且體重增加，說明試驗用CpG無異常毒性。

3.2.3 CpG超敏反應 昆明小鼠在超敏試驗過程中未出現蜷縮、抽搐、被毛立起及休克等超敏反應。

3.2.4 臨床表現 試驗期間各組動物活動狀態、被毛體態、飲食欲未見異常。

3.2.5 病理學檢查 末次給藥后24h，處死并剖檢小鼠，檢查小鼠臟器有無異常變化。結果，試驗組和對照組小鼠無明顯區別，各臟器均正常。

續表2

4 討論

自從20世紀20年代以來，研究者們均嘗試以各種物質作為疫苗的佐劑從而使疫苗更有效。迄今為止，只有氫氧化鋁膠佐劑被食品藥品監督管理局（FDA）獲準了在人類和動物疫苗中應用，但它不能誘導產生Thl型反應，且干擾細胞免疫，使得疫苗的免疫保護不全面、不持久，也存在輕度局部反應、形成肉芽腫、局部無菌性膿腫等副作用，同時，有可能對人、畜神經系統有影響等[7]。因此，研制新型的可誘導Thl型免疫反應，且安全、有效、無毒副作用的佐劑成了眾多學者研究的熱點。

CpG-DNA可誘導Thl型免疫應答或調節免疫應答向Thl型免疫應答轉換，使機體特異性體液免疫反應增強。另外，CPG-DNA刺激淋巴細胞產生的細胞因子可作用于相同或不同類型的免疫細胞，從而組成復雜的免疫網絡，并具有免疫調節作用。其免疫增強活性較氫氧化鋁膠等常規佐劑高得多，既可用于滅活疫苗，也可用于活疫苗，而且與其他佐劑有強烈的協同作用，可增強一些弱抗原的免疫原性。CPG-DNA幾乎作為所有蛋白質抗原和滅活疫苗的佐劑，而且在與其他佐劑合用時還可彌補其他佐劑誘導Th2性免疫應答的缺陷，此外，一些不能與鋁鹽佐劑混合的減毒活疫苗或多價疫苗，CpG-DNA則可作為佐劑單獨使用。

本試驗依據CpG-DNA特性，制備出32條CpG序列，通過淋巴細胞增殖試驗篩選出4個對羊、小鼠淋巴細胞都有較強細胞增殖作用的序列，分別為L4、K13、CFNCpG3、CP6。

通過對選出的CpG進行無菌試驗、超敏試驗和異常毒性試驗的結果初步的研究分析表明，實驗篩選出的CpG-DNA無菌、無異常毒性、無超敏反應。小鼠的亞急性毒性試驗結果顯示，各劑量組未見明顯的毒性反應，解剖檢查均無明顯異常，說明該試驗已取得較為滿意的結果，為CpG佐劑的研制與應用提供了理論依據。