人參中人參總皂苷測定方法研究

逄世峰，王佳，鄭培和，許世泉，張浩，崔麗麗，馬瑩，王英平※，梁毅，單巍

（1.中國農業科學院特產研究所，長春 130112；2.吉林醫藥學院附屬醫院，吉林 吉林 132013；3.康美新開河吉林藥業有限公司，吉林 集安 134299

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）系五加科人參屬多年生草本植物，在中國已有數千年的藥用歷史，《神農本草經》中記載：“人參，味甘、微苦，微溫。主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心、益智、久服輕身延年”[1]。人參皂苷是人參中的主要活性成分[2，3]，各國藥典均以人參皂苷做為藥材質量評價指標[4]。目前，人參的質量評價大多采用液相色譜法測定人參皂苷的含量，但往往忽略了齊墩果烷型人參皂苷和丙二酰基人參皂苷[5～7]，這2種類型人參皂苷具有獨特的藥理活性[8～10]。

本研究通過氨水將丙二酰基人參皂苷轉化為相應的中性皂苷，采用超高效液相色譜測定人參中人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 含量，為人參產品質量評價及標準制定提供理論參考。

1 試驗儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Acquity（Waters公司）；乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水（Millipore），磷酸為優級純，其他試劑均為分析純；人參皂苷Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 材料

人參樣品分為自制樣品和成品，自制樣品為采自黑龍江省和吉林省的不同產地鮮人參自制加工的生曬參，采樣時間為2016年9月20日～2016年10月30日，共收集樣品30份。經中國農業科學院特產研究所許世泉副研究員鑒定，全部樣品均為五加科植物人參。成品購自吉林省、上海市、杭州市，參根于50°C烘干至恒重，粉碎，過60目篩，待測。樣品采集信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information form

續表1

續表1

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 標準品 2.96mg、3.54mg、2.18mg、2.34mg、4.34mg、4.46mg、3.49mg、1.66mg、3.86mg，置于 10mL容量瓶中，加甲醇配置成不同濃度的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取1.0g的樣品粉末，精密稱定，置于50mL具塞磨口三角瓶中，加入25mL氨-水-甲醇溶液（NH3+H2O+CH3OH=4+21+75），密塞，超聲提取 30min（功率500W，頻率40kHz），靜置48h，取上清液，過微孔濾膜，待測。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 50mm，流動相：乙腈-0.0005%磷酸水溶液（梯度洗脫：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～4.5min，21%～24% 乙 腈；4.5min～5min，24%～28%乙腈；5min～6.5min，28%乙腈；6.5min～7.5min，28%～30%乙腈；7.5min～9.5min，30%～36%乙腈；9.5min～11min，36%～40%乙腈），流速 0.5mL/min，柱溫35℃，進樣量

2.4 線性關系考察與定量限（LOQ）、檢測限（LOD）

將混合對照品溶液分別用甲醇稀釋100倍、5倍、2.5倍、1.25倍、1倍，制成一系列濃度的混合標準品溶液，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。各種人參皂苷檢出限（LOD）和定量限（LOQ）由3倍和10倍信噪比計算而來。結果見表2。

表2 線性方程、相關系數及檢出限Table 2 Linear equation，correlation coefficient and detection limit

2.5 重復性試驗

取供試人參樣品，精密稱取6份，按供試品溶液的制備方法處理，進樣分析，測得人參皂苷Rg1平均含量為0.45%、RSD 0.78%，Re平均含量為0.39%、RSD0.71%，Rf平均含量為 0.11%、RSD1.62%，Ro平均含量為0.41%、RSD 0.4%，Rb1平均含量為1.23%、RSD0.54%，Rc平均含量為 0.56%、RSD0.4%，Rb2平均含量為0.57%、RSD0.48%，Rb3平均含量為0.1%、RSD1.94%，Rd平均含量為0.34%、RSD0.74%，表明重復性良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d 按上述色譜條件進樣分析，結果人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 峰面積的RSD分別為1.01%、1.02%、0.71%、1.14%、0.96%、0.48%、1.04%、1.47%、1.11%，表明供試品溶液在7d內穩定。

2.7 回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品粉末6份，添加一定量的人參皂苷對照品，按“2.2”項下制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結果見表3。

表3 加樣回收率Tab.3 Recovery of sample (n=6)

2.8 樣品測定

按照“2.2”項下供試品溶液的制備方法操作，按照“2.3”項下色譜條件測定樣品。人參中主要含有Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷，生曬參片中人參皂苷含量較低（樣品32、43、44），生曬參須中人參皂苷含量較高（樣品49、50、51），光支生曬參和全須生曬參主要人參皂苷含量之和在2.11%～6.01%之間。結果見表4，色譜圖見圖1。

圖1 標準品（A）和樣品（B）超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

表4 人參中9種人參皂苷含量Tab.4 Content of nine ginsenosides in the roots of ginseng

續表4

3 討論

丙二酰基人參皂苷是生曬參中人參皂苷的主要組成成分，丙二酰基人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量約占人參總皂苷的1/3[11]。韓國藥典中采用氫氧化鈉將丙二酰基人參皂苷轉化為相應的中性皂苷，后用鹽酸中和樣品溶液[12]。該方法溶液穩定性較差，轉化后的中性皂苷不穩定。本方法采用氨水轉化丙二酰基人參皂苷，溶液穩定性良好。

為了明確丙二酰基人參皂苷轉化情況，本研究考察了 12h、24h、36h、48h、60h共 5個時間點，結果表明，48h后相應中性人參皂苷含量不再增加，丙二酰基人參皂苷已轉化完全。因此，提取時間應控制在48h以上。

流動相中磷酸的濃度直接影響齊墩果酸型人參皂苷Ro的峰型和分離度，本研究分別將25%磷酸加入500mL水中，考察不同濃度磷酸溶液流動相對色譜分離的影響，結果表明，乙腈 0.000 5%磷酸水溶液作為流動相時，Ro峰型和色譜分離良好，見圖2。

圖2 不同濃度磷酸UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of different concentration of phosphoric acid

綜上，人參中主要含有 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷，且含有大量 M-Rb1、MRb2、M-Rc、M-Rd丙二酰基人參皂苷，僅以某種或幾種人參皂苷作為評價指標會低估人參總皂苷的含量。相比而言，先將丙二酰基人參皂苷轉化為相應的中性皂苷，再將各單體皂苷進行加和作為人參質量評價指標更為合理。