SIRT2沉默對胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲的影響

牛虹，楊峰，唐靜雯，田同德，李華華，岳光星，范伊曉，周浩本

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SIRT2沉默對胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲的影響

牛虹，楊峰，唐靜雯，田同德，李華華，岳光星，范伊曉，周浩本

450008 鄭州大學附屬腫瘤醫院中西醫結合腫瘤內科

探究沉默信息調節蛋白 2（SIRT2）對人胃癌 SGC-7901 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制。

采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測 SIRT2 在胃癌 SGC-7901 細胞和正常胃上皮 GES-1 細胞中的表達。采用 RNA 干擾技術處理 SGC-7901 細胞，SIRT2 沉默組轉染靶向 SIRT2 的干擾小 RNA（SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組），陰性對照組轉染 SIRT2-siRNA 陰性對照序列，空白對照組不轉染。CKK-8 法和平板細胞克隆形成實驗檢測 SGC-7901 細胞增殖，Transwell 法檢測 SGC-7901 細胞侵襲遷移能力，蛋白印跡檢測 SGC-7901 細胞中 SIRT2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）和磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）蛋白表達。

人胃癌細胞 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均高于正常胃上皮 GES-1 細胞（< 0.05）。轉染SIRT2-siRNA 的 SGC-7901 細胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均低于陰性及空白對照組（< 0.05）；轉染SIRT2-siRNA 后，SGC-7901 細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力均降低（< 0.05）；轉染SIRT2-siRNA 后SGC-7901 細胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度顯著下降（< 0.05）。

SIRT2 在胃癌細胞中表達上調，沉默 SIRT2 可能通過調節 PI3K/Akt 通路抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，推測 SIRT2 可能作為潛在靶標應用于胃癌的基因治療。

沉默信息調節蛋白 2； 胃癌； 增殖； 侵襲； 遷移

胃癌（gastric cancer，GC）是一類發生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，流行病學研究顯示，GC 的發病率在世界范圍內居第五位，死亡率居第三位[1]。雖然近年關于 GC 的檢測和治療技術取得很大改進，但 GC 患者的 5 年存活率仍很低，低于 30%[2]。由于 GC 患者早期無特異性癥狀，確診時多數已進展至晚期，甚至轉移至遠端器官，研究顯示，轉移是導致GC 患者死亡的重要原因[3]，然而影響胃癌轉移的機制尚不完全明確。因此，探究胃癌的轉移、進展機制，有利于篩選更有效的治療分子靶點，對于延長 GC 患者存活時間，改善預后具有重要意義。沉默信息調節蛋白 2（sirtuin-2，SIRT2）是組蛋白去乙酰化酶家族的一員，參與調解氧化應激、細胞程序性死亡等生物過程[4-5]。Hoffmann 等[6]研究發現，抑制 SIRT2 表達可明顯促進非小細胞肺癌細胞的凋亡，降低遷移和侵襲能 力，然而目前尚缺少 SIRT2 對胃癌細胞的影響相關研究。本文在上述研究基礎上，通過轉染靶向作用于 SIRT2 的干擾小 RNA（siRNA），觀察沉默 SIRT2 對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其機制，以期為胃癌的臨床診療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌細胞系 SNU-1、KATO III、SGC-7901 細胞和人正常胃上皮 GES-1 細胞購自中國科學院細胞庫；胎牛血清和 RPMI-1640 培養基購自美國ThermoFisher 公司；LipofectamineTM3000 轉染試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix、Trizol 試劑、蛋白提取試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Transwell 小室購自美國 BD 公司；SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2、SIRT2-siRNA陰性對照（negative control，NC）序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔源磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體、兔源 p-PI3K 抗體、兔源絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threoninekinase，Akt）抗體、兔源 p-Akt 抗體和綴合辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔二抗購自美國 Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SNU-1、KATO III、SGC-7901 及 GES-1 細胞常溫條件下復蘇，采用加有 10% 胎牛血清的新鮮 RPMI-1640 進行培養，加入鏈霉素、青霉素，放入 CO2培養箱常規進行傳代培養，每兩天更換一次培養基。穩定2 ~ 3 代后，細胞處于對數生長期時，收集用于實驗。每種細胞設置5 個重復。

1.2.2 細胞轉染及分組 收集穩定傳代的對數期 SGC-7901 細胞，加入胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，以 1 × 105個/孔密度接種于 6 孔培養板，培養至細胞融合達 80% 左右，更換為不含胎牛血清的新鮮RPMI-1640 培養基，遵循 LipofectamineTM3000 試劑盒操作說明進行轉染。實驗分四組：空白對照組：不對SGC-7901 細胞轉染任何外源序列；陰性對照組：對SGC-7901 細胞轉染終濃度為 100 nmol/LSIRT2-siRNA NC 序列；SIRT2-siRNA 1 組：對SGC-7901 細胞轉染終濃度為 100 nmol/L SIRT2-siRNA1 序列；SIRT2-siRNA 2 組：對SGC-7901 細胞轉染終濃度為 100 nmol/L SIRT2-siRNA2 序列，每組設置 5 個重復。轉染后置于培養箱中常規培養 6 h，更換為加有 10% 胎牛血清的新鮮RPMI-1640 培養基繼續培養 48 h。收集各組 SGC-7901 細胞，實時熒光定量（real time quantitative，qRT）-PCR和蛋白印跡（Western blot）檢測轉染效率。

1.2.3 CKK-8 法檢測SGC-7901 細胞增殖 將各組 SGC-7901 細胞分別以 5000 個/孔密度接種至 96 孔板，培養 0、12、24、36、48、60、72 h 后，遵循 CKK-8 檢測試劑盒操作說明進行實驗，檢測各孔細胞在 450 nm 波長下的光密度（），繪制生長曲線。

1.2.4 平板細胞克隆實驗檢測SGC-7901 細胞增殖 將各組 SGC-7901 細胞制備單細胞懸液，以1000 個/皿密度接種至加有 6 ml RPMI-1640 的培養皿中，移液槍輕輕吹打混勻，置于 CO2培養箱中培養，每 12 小時觀察一次細胞生長情況。當肉眼觀察到明顯細胞克隆形成時，將培養皿取出，統計培養皿中形成克隆的細胞數量，計算 SGC-7901 細胞克隆形成率，每組設置 5 個重復。克隆形成率=（形成克隆的細胞數量/ 1000）× 100%。

1.2.5 Transwell 法檢測SGC-7901 細胞遷移和侵襲 將 Transwell 小室放入 24 孔板，收集各組 SGC-7901 細胞制備單細胞懸液，以 10 000 個/孔密度接種于小室上層，小室下層加入 600 μl含胎牛血清RPMI-1640 培養基，于 CO2培養箱孵育 24 h，取出小室，清洗風干后，95% 乙醇固定，加入 0.5% 結晶紫染色 15 min，洗去多余染液，小心去除小室濾膜上層未遷移細胞，置于顯微鏡拍照并統計遷移至濾膜下層的細胞數量。細胞侵襲實驗首先將小室 50 μl 2.0 mg/ml 基底膠加入小室上層，膠凝晾干后接種SGC-7901 細胞，后續步驟同遷移實驗。每組設置 5 個重復。

1.2.6 Western blot 檢測 PI3K、Akt 蛋白表達情況 將各組 SGC-7901 細胞收集，采用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度。分別取適量蛋白加入十二烷基苯磺酸鈉（SDS）煮沸后，上樣，采用 8% ~ 10% SDS-聚丙烯（PAGE）膠分離不同分子量的蛋白質。采用半干轉膜儀將蛋白質由 PAGE 膠轉至硝酸纖維膜，加入 5% 脫脂牛奶常溫封閉 25 min；分別加入 1:1000 稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；洗去一抗后，分別加入 1:5000 稀釋的羊抗兔二抗，常溫孵育 45 min；洗去二抗后，加入化學發光液，采用 Tanon 軟件拍攝圖像，以目的蛋白條帶灰度值/內參 GAPDH 條帶灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 SIRT2 在人胃癌細胞系中高表達

人胃癌細胞 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均顯著高于正常胃上皮 GES-1 細胞（< 0.05），結果見圖 1、表 1。

2.2 轉染效果檢測

陰性對照組 SGC-7901 細胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平與空白組比較，差異無統計學意義 （> 0.05）；SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901 細胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均顯著低于陰性及空白對照組（< 0.05），見圖 2、表 2。

2.3 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 細胞增殖

陰性對照組 SGC-7901 細胞增殖能力與空白組比較，差異無統計學意義（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901 細胞增殖能力顯著低于陰性及空白對照組（< 0.05），結果見圖 3。

圖 1 SIRT2 在人胃癌細胞系中表達情況

Figure 1 SIRT2 expression in human gastric cancer cell lines

細胞系Cell lineSIRT2/GAPDH mRNAProtein GES-11.05 ± 0.221.08 ± 0.24 SNU-13.19 ± 0.61*2.08 ± 0.32* KATO III3.25 ± 0.71*2.11 ± 0.36* SGC-79014.59 ± 0.89*2.47 ± 0.48*

注：n = 5，與 GES-1 細胞比較，*< 0.05。

Note: n = 5, compared with GES-1 cells,*< 0.05.

圖 2 轉染 SIRT2-siRNA 對 SGC-7901 細胞 SIRT2 表達的影響

Figure 2 Effect of SIRT2-siRNA transfection on SIRT2 expression in SGC-7901 cells

表 2 轉染 SIRT2-siRNA 對 SGC-7901 細胞SIRT2 表達的影響（）

注：n = 5，與空白組比較，*< 0.05；與陰性組比較，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

2.4 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 細胞平板克隆形成

陰性對照組 SGC-7901 細胞平板克隆形成率與空白組比較，差異無統計學意義（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901細胞平板克隆形成率顯著低于陰性及空白對照組（< 0.05），結果見表 3。

圖 3 沉默 SIRT2 對SGC-7901 細胞增殖的影響（n = 5，與空白組比較，*P < 0.05；與陰性組比較，#P < 0.05）

Figure 3 Effect of silencing SIRT2 on the proliferation of SGC-7901 cells (n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05)

表 3 沉默 SIRT2 對 SGC-7901 細胞平板克隆形成率的影響（）

注：n = 5，與空白組比較，*< 0.05；與陰性組比較，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

2.5 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 細胞遷移、侵襲能力

如圖 4 和表 4 所示，陰性對照組發生遷移和侵襲的 SGC-7901 細胞數量與空白組比較，差異無統計學意義（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組發生遷移和侵襲的 SGC-7901 細胞數量顯著低于陰性和空白對照組（< 0.05）。

2.6 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 細胞中 Akt、PI3K 磷酸化程度

陰性對照組、空白組、SIRT2-siRNA 組 SGC-7901 細胞中 Akt、PI3K 蛋白表達總量比較，差異無統計學意義（> 0.05）。陰性對照組 SGC-7901 細胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度與空白組比較，差異無統計學意義（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 組、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901細胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度顯著低于陰性和空白對照組（< 0.05），結果見圖 5、表 5。

圖 4 沉默 SIRT2 對 SGC-7901 細胞遷移（A）、侵襲（B）的影響（標尺 = 100 μm）

Figure 4 Effect of silencing SIRT2 on migration (A) and invasion (B) of SGC-7901 plate clones (scale = 100 μm)

表 4 沉默 SIRT2 對 SGC-7901 細胞遷移能力的影響（）

注：n = 5，與空白組比較，*< 0.05；與陰性組比較，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

3 討論

我國的胃癌發生率很高，目前已居于常見惡性腫瘤的第一位。胃癌患者早期癥狀不具有特異性，因此發現患病時多已進展至晚期，手術效果有限，目前主要使用手術結合化療的治療策略，但化療的毒副作用大且腫瘤細胞易產生抗藥性[7]。胃癌患者在疾病晚期多出現腫瘤病灶浸潤和遠處轉移、侵襲，嚴重影響治療效果，導致患者預后差，死亡率高[8]。因此，探究胃癌細胞轉移和侵襲機制，尋找關鍵生物分子，可為其臨床診斷和治療提供新思路。

圖 5 沉默 SIRT2 對 SGC-7901 細胞 Akt、PI3K 磷酸化程度的影響

Figure 5 Effects of silencing SIRT2 on the phosphorylation of Akt, PI3K in SGC-7901cells

SIRTs 是一類依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的去乙酰化酶，共包括 SIRT1 ~ SIRT7 七種同源蛋白，在肌肉、胃、腎臟等多種組織器官中表達[9]。SIRTs 通過調節組蛋白乙酰化/去乙酰化水平，調節 DNA 與組蛋白的結合狀態，影響基因轉錄，在能量代謝、炎癥反應、氧化還原平衡等生理過程中發揮重要作用[10]。Cheng 等[11]發現，SIRT1 在結直腸癌腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織，與患者遠處轉移、總體生存率有關，細胞實驗表明，沉默 SIRT1 表達可顯著抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲。Grbesa 等[12]發現，SIRT2 蛋白在非小細胞肺癌細胞系 NSCLC 細胞和肺原發腫瘤組織中表達高于正常肺上皮細胞和正常組織，SIRT2 高表達與肺癌患者無復發生存期有關，下調 SIRT2 表達可顯著抑制 NSCLC 細胞增殖，推測 SIRT2 在肺癌中具有致癌作用。本研究發現，SIRT2 在胃癌細胞系 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中均顯著高表達，與 Li 等[13]研究一致，提示SIRT2 可能參與胃癌發生。

表 5 沉默 SIRT2 對 SGC-7901 細胞 Akt、PI3K 磷酸化程度的影響（）

注：n = 5，與空白組比較，*< 0.05；與陰性組比較，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

腫瘤的發生涉及多種因素共同作用，當惡性腫瘤發生時，細胞在基因水平上對自身的控制出現紊亂，細胞增殖出現異常，細胞侵襲能力顯著增加，表現為浸潤式生長，導致腫瘤發生[14]。細胞異常增殖是腫瘤發生的基礎，細胞遷移和侵襲是腫瘤發生遠端轉移的基礎。本研究以 SIRT2 表達水平最高的 SGC-7901 細胞作為沉默 SIRT2 表達的載體，結果發現，轉染 SIRT2-siRNA 后，SGC-7901 細胞 SIRT2 表達明顯上調，表明轉染成功，效率較高。進一步觀察發現，SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901 細胞生長速度、平板克隆形成率、發生遷移和侵襲的細胞數量均顯著低于陰性和空白對照組，表明沉默 SIRT2 可有效抑制胃癌 SGC-7901 細胞增殖、遷移和侵襲能力，與冉龍寬等[15]對肝癌細胞增殖能力的研究一致。

PI3K/Akt 通路是細胞內一種調控細胞增殖、細胞侵襲的重要信號轉導通路之一。作為通路中關鍵因子，PI3K 被磷酸化激活后，可催化細胞中 PIP2 轉化為有活性的 PIP3，作用于下游靶蛋白 Akt 促進其磷酸化；活化的 Akt 由細胞質轉移至細胞膜，傳遞生物學信號，進一步促進其下游細胞增殖、細胞遷移等相關靶基因轉錄活化，調節細胞功能[16]。研究表明，PI3K/Akt 信號通路的異常激活可促進多種腫瘤細胞增殖和遷移，與多種惡性腫瘤的嚴重程度有關[17]。Yang 等[18]發現，轉錄因子 SOX2 可通過誘導 PI3K/Akt 通路激活，促進人喉癌細胞的遷移和侵襲。Yan 等[19]研究證實，miR-21 在人乳腺癌細胞中可通過直接靶向 PI3K，抑制 PI3K/Akt 通路活化，從而抑制乳腺癌細胞生長、遷移和轉移。近年研究發現，SIRT2 與 Akt 活化相關，SIRT2 過表達可增強 Akt 及其下游靶基因活化[20]。為探究 SIRT2 對胃癌細胞增殖、侵襲的作用機制，本研究對轉染 SIRT2-siRNA 后，SGC-7901細胞中 PI3K、Akt 表達情況進行檢測，結果發現，SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2 組 SGC-7901 細胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度均顯著降低，表明沉默 SIRT2 表達可有效抑制PI3K/Akt 通路激活，提示SIRT2 可能通過 PI3K/Akt 通路調節胃癌細胞的增殖、遷移和轉移。

綜上所述，SIRT2 在胃癌細胞中表達上調，沉默 SIRT2 可抑制 PI3K/Akt 通路激活，抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，表明 SIRT2 可能通過 PI3K/Akt 通路調節胃癌細胞的增殖、遷移和轉移，推測 SIRT2 可能是胃癌基因治療的潛在作用靶標。

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Influences of SIRT2 silence on proliferation, migration and invasion of gastric cancer SGC-7901 cells

NIU Hong, YANG Feng, TANG Jing-wen, TIAN Tong-de, LI Hua-hua, YUE Guang-xing, FAN Yi-xiao, ZHOU Hao-ben

Oncology Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Cancer Center of Zhengzhou University, Henan 450008, China

To investigate the influences and mechanisms of silencing sirtuin-2(SIRT2) on proliferation, migration and invasion of human gastric cancer SGC-7901 cells.

The expressions of SIRT2 in gastric cancer SGC-7901 cells and normal gastric epithelial GES-1 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The SGC-7901 cells were treated with RNA interference technique, the SIRT2 silence group was transfected with interfering small RNAs targeting SIRT2 (group SIRT2-siRNA1, group SIRT2-siRNA2), the negative control group was transfected with SIRT2-siRNA negative control sequence, blank control group was not transfected. CKK-8 assays and panel cell colony formation experiments were used to detect the proliferation of SGC-7901 cells. Transwell assay was applied to detect the invasion and migration abilities of SGC-7901 cells. The expressions of SIRT2, serine/threonine rotein kinase (Akt) and phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) in SGC-7901 cells were detected by Western blot.

SIRT2 mRNA and protein levels in human gastric cancer cells SNU-1, KATO III and SGC-7901 were higher than those in normal gastric epithelial GES-1 cells (< 0.05). The levels of SIRT2 mRNA and protein in SGC-7901 cells transfected with SIRT2-siRNA were lower than those in negative and blank control groups (< 0.05); after SIRT2-siRNA transfection, the proliferation, clonality, migration and invasion of SGC-7901 cells were decreased (< 0.05); after transfection of SIRT2-siRNA, the phosphorylation of Akt and PI3K proteins in SGC-7901 cells were decreased significantly (< 0.05).

SIRT2 is up-regulated in gastric cancer cells and SIRT2 silence may inhibit proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells by regulating PI3K/Akt pathway, on which it is speculated that SIRT2 may be used as a potential target for gene therapy of gastric cancer.

Sirtuin-2; Gastric cancer; Proliferation; Invasion; Migration

ZHOU Hao-ben, Email: blueskya143@126.com

周浩本，Email：blueskya143@126.com

2018-08-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.008