許曉雙，張大為

?

以HIV-1 IN-LEDGF/p75相互作用為靶點的抑制劑篩選

許曉雙，張大為

213001 常州，江蘇理工學院生物信息與醫藥工程研究所

晶狀體上皮源性生長因子 p75 蛋白（LEDGF/p75）與 HIV-1 整合酶（IN）之間的蛋白-蛋白相互作用是開發抗 HIV-1 藥物的有效靶點，本文旨在尋找以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用為靶點的小分子抑制劑。

采用均相時間分辨熒光技術（HTRF）篩選了 799 個化合物，比對 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制活性。

發現 5 個化合物——腎上腺酮、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮、頭孢噻吩、根皮含柘樹呫噸酮 L 和迷迭香酸對該相互作用表現出不同程度的抑制作用，其 IC50值分別為 12.3、22.7、26.2、18.5 和 1.13 μmol/L。

為 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑的發現以及新的抗 HIV-1 藥物的開發提供了重要基礎。

HIV 整合酶； HIV 整合酶抑制劑； LEDGF/p75； 均相時間分辨熒光技術； 蛋白-蛋白相互作用

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是引起獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原體。HIV 屬于逆轉錄病毒科（）慢病毒屬（），是一類潛伏期很長的病毒。人群中流行的 HIV 病毒主要有 2 種亞型：HIV-1 和 HIV-2。HIV-1 具有較高的毒力，更容易傳播同時也導致了全球大多數國家的 HIV 感染[1]。目前，針對該病毒缺乏有效的疫苗或者治愈手段，而針對病毒復制不同階段開發的化學治療藥物仍然是防治艾滋病的有效途徑[2]。

HIV-1 整合酶（integrase，IN）介導逆轉錄后形成的病毒 DNA 與宿主細胞基因組的整合，是病毒復制所必需的關鍵酶，也是研究抗艾滋病藥物的重要靶標[3]。目前，經美國 FDA 批準上市的 IN 抑制劑有 3 個，包括雷特格韋（raltegravir，RAL）、埃替格韋（elvitegravir，EVG）和度魯特韋（dolutegravir，DTG），均為 IN 鏈轉移反應抑制劑（integrase strand transfer inhibitors，INSTIs）[4-5]。隨著 3 種 INSTIs 在臨床的應用，針對它們的耐藥性突變病毒株已經出現[6]。因此，尋找新的作用機制靶點以開發新的 IN 抑制劑顯得尤為迫切和重要。

HIV-1 自身編碼的蛋白質數量有限，需要依賴宿主細胞蛋白及其信號通路完成自身復制。其中參與整合的宿主蛋白稱為整合輔因子（integration cofactors，INCFs）[7]。目前，研究最為清楚的 INCF 為晶狀體上皮源性生長因子 p75 蛋白（lens epithelium-derived growth factor，LEDGF/p75）[8]。LEDGF/p75 也是首個被發現的能與 HIV-1 IN 發生蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）的宿主蛋白。該 PPI 主要由 LEDGF/p75 蛋白 C 端 IN 結合區（integrase-binding domain，IBD）與 HIV-1 IN 催化核心區（catalytic core domain，CCD）作用形成，研究表明該蛋白-蛋白相互作用是開發抗 HIV-1 藥物的有效靶點[8]。

目前，盡管文獻已經報道了許多 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑，但還沒有一個該類抑制劑上市用于抗病毒治療。因此，積極尋找和設計新的 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑，具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景。本文以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用為靶點，采用均相時間分辨熒光（homogeneous time resolved fluorescence，HTRF）技術，篩選了 799 個化合物抑制相互作用的活性，旨在尋找更多的 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制劑，為開發新的抗 HIV-1 藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌（）菌株 BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；pMD-18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司；表達載體 pET28a、pGEX-4T-1、重組質粒 pET28a-IN-dm（表達 N 端融合 6 × His 標簽含有 F185K/C280S 可溶型雙突變 IN）和 pGEX-4T-p75（表達 N 端融合 GST 標簽的 p75 蛋白）由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 小分子化合物購自國家小分子化合物資源中心，其中399 個來自 InterBioScreen 公司（簡稱IB）的活性化合物庫，400 個來自 BioBioPha 公司（簡稱BBP）的結構類型多樣的天然產物庫；Ni-NTA 與 GST 純化柱填料購自常州天地人和生物科技有限公司；Anti-6His-XL665 受體磁珠和 Anti-GST-Cryptate 供體磁珠購自法國 Cisbio 公司；384 孔聚丙烯淺孔微孔板和 Envision 2102 multilabel reader 多功能酶標儀購自美國Perkin Elmer 公司；BE-9008 微孔板恒溫振蕩器購自其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GST-IBD 的表達純化 以構建好的重組質粒 pGEX-4T-p75 為母本質粒，PCR 擴增 p75 IBD 結構域（第 347-429 為氨基酸殘基）表達序列，克隆至表達載體 pGEX-4T-1 的H I-I 位點。正確構建的含 p75 IBD 編碼基因的重組表達質粒命名為 pGEX-4T-IBD，然后轉化至BL21（DE3），培養過夜挑取單個克隆，37 ℃振蕩培養過夜，按 1:100 的比例擴大培養至對數中期，0.5 mmol/L IPTG 30 ℃誘導表達 3 h，收集菌體。裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），500 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF]重懸菌體，超聲破菌，離心收集上清。利用GST 瓊脂糖凝膠 FF 親和色譜柱純化 LEDGF/p75融合蛋白。用洗脫 buffer[50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），500 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，20 mmol/L 還原型谷胱甘肽]洗脫目的蛋白，具體純化步驟參考文獻[9]。采用 SDS-PAGE 檢測蛋白表達純化，BCA 法測定蛋白質含量。

1.2.2 IN-HIS 的表達純化 以重組質粒 pET28a-N-IN-dm 為母本質粒，PCR 擴增 IN CCD 結構域（第 50-212 為氨基酸殘基）表達序列，克隆至表達載體 pET28a 的I-I 位點。正確構建的含 IN CCD 編碼基因的重組表達質粒命名為 pET28a-IN-CCD，然后轉化至BL21（DE3），培養過夜挑取單個克隆，37 ℃振蕩培養過夜。按照 1:100 的比例擴大培養至對數中期，1 mmol/L IPTG 30 ℃誘導表達 4 h，收集菌體。裂解液[20 mmol/L HEPES（pH 7.3），1 mol/L NaCl，2 mmol/L β-ME，10% 丙三醇，0.1% NP-40]重懸菌體，超聲破菌，離心收集上清。利用 Ni-瓊脂糖凝膠 6FF 親和色譜柱純化 IN-HIS 融合蛋白。用洗脫 buffer[20 mmol/L HEPES（pH 7.3），1 mol/L NaCl，2 mmol/L β-ME，10% 丙三醇，250 mmol/L 咪唑]洗脫目的蛋白，檢測方法同 1.2.1。

1.2.3 基于 HTRF 的 IN-IBD 相互作用抑制劑的篩選方法 當 C-端帶有 His標簽的 HIV-1 IN（IN-HIS）和 N 端帶有 GST 標簽的 IBD（GST-IBD）蛋白相互作用時（空間距離小于10 nm），Anti-6His-XL665 受體磁珠和Anti-GST-Cryptate 供體磁珠也會相應靠近，從而發生共振能量轉移（FRET）現象[10]。供體磁珠熒光分子的激發將誘發受體分子發出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。當抑制劑分子阻斷 IN-HIS 和 GST-IBD 的相互作用時，FRET 現象減弱。因此 FRET 現象的強弱可以反映抑制劑分子對兩個蛋白相互作用抑制作用的強弱，從而該方法可以用于 IN 與 IBD 相互作用抑制劑的篩選。

HTRF 實驗在 384 孔板進行，所用蛋白和化合物均用反應 buffer[25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol/L NaCl，1 mg/ml BSA，0.1% NP40，2 mmol/L MgCl2]稀釋。將以下成分加入 384 孔板中：4 μl 50 nmol/L IN、4 μl 25 nmol/L IBD、2 μl 化合物，混勻后 25 ℃、200 r/min 反應 30 min。然后加入 5 μl 0.8 nmol/L 的 GST-Cryptate 供體磁珠和 5 μl 4 nmol/L 的 Anti-6His-XL665 受體磁珠（含 100 mmol/L KF），混勻后 25 ℃，200 r/min 反應 1 h。使用多功能酶標儀，以 320 nm 為激發光，讀取 665 nm 和 620 nm 處的發射光。以 BI-224436 作為陽性對照。

1.2.4 Z 因子的測定 為了評價所構建的 HTRF 篩選 GST-IBD 與 IN-HIS 相互作用抑制劑方法的質量與穩定性，分別測定了 Z 因子、信號窗（signal window，SW）和 CV 等主要參數。當 Z 因子> 0.5、SW > 2、CV < 20% 時，該篩選方法的結果正確可信。此外，高通量篩選方法的信號噪音比（signal-to-ratio，S/N）> 10，信號背景比（signal-to-background，S/B）值> 3，該高通量篩選方法才具有高靈敏度和高特異性。Z 因子、S/N、S/B 的計算公式如下：

Z = 1 –3 ×（SDmax– SDmin） |Mmax– Mmin|

S/N =Mmax– Mmin SDmin

S/B =Mmax Mmin

Mmax：最大信號值的平均值；Mmin：最小信號值的平均值；SDmin：最小信號值的標準偏差；SDmax：最大信號值的標準偏差。

1.3 數據處理

分別計算各孔 665 nm 和 620 nm 處熒光強度的比值（Ration 665/620），并計算各孔的相對抑制率。活性樣品進行濃度稀釋后檢測相對抑制率，使用軟件 Graphpad 6.0 作圖計算半數抑制濃度 IC50值。

2 結果

2.1 GST-IBD 與 IN-HIS 的表達純化結果

圖 1A 為 GST-IBD 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達結果，GST-IBD 在經 0.5 mmol/L 的 IPTG 誘導后，目的蛋白（36.89 kD）蛋白量明顯增多，通過 GST 柱純化，并用 20 mmol/L 谷胱甘肽洗脫檢測得到 GST-IBD 蛋白，蛋白條帶清晰可見，沒有非特異性條帶，以 BSA 作為標準品，使用 BCA 法測得 GST-IBD 蛋白的濃度約為 0.28 mg/ml。

圖 1B 為IN-HIS 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達結果，IN-HIS 在經 1 mmol/L 的 IPTG 誘導后，蛋白（32.96 kD）表達量明顯增多，通過 Ni-NTA 柱純化，并用 250 mmol/L 咪唑洗脫檢測得到 IN-HIS 蛋白，蛋白條帶清晰可見，沒有非特異性條帶，以 BSA 作為標準品，使用 BCA 法測得 IN-HIS 蛋白的濃度約為 0.37 mg/ml。

2.2 HTRF 方法穩定性分析

Z 因子、信號窗（SW）和 CV 是評價藥物篩選方法均一性和穩定性的重要參數。如圖 2 所示，Z 因子、SW 值、CV 值分別為 0.89、21.05、4.09%，符合 Z 因子 > 0.5、SW > 2、CV < 20%，說明篩選結果是正確可信的；S/N 與 S/B 的值分別為 172.07 與 3.83，符合 S/N > 10，S/B > 3，說明該篩選方法具有高靈敏度和高特異性。

2.3 IB 庫中 IN-LEDGF/p75 抑制劑篩選結果

將 IB 庫中 399 個化合物進行抑制 IN-LEDGF/p75 活性篩選，每個化合物初篩體系終濃度為 50 μmol/L，重復 2 次。初篩結果顯示，化合物腎上腺酮（adrenalone）、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮（bonaphton）、頭孢噻吩（cefalotin）對 IN-LEDGF/p75 抑制活性均達到 90% 以上。將這 3 個化合物在反應體系中的終濃度以 50 μmol/L 作為起始濃度進行倍比稀釋，測定3 個化合物對 IN-LEDGF/p75 的抑制百分率，通過非線性擬合得到 IC50值（圖 3 ~圖 5）。結果顯示，腎上腺酮、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮、頭孢噻吩的 IC50值分別為 12.3、22.7和 26.2 μmol/L。

圖 1 SDS-PAGE 檢測 GST-IBD 與 IN-HIS 的表達純化結果[A：GST-IBD（M：分子量標準；1：上清；2：誘導后；3：誘導前；4：20 mmol/L GSH洗脫）；B：IN-HIS（1：誘導前；2：誘導后；3：上清；4：250 mmol/L 咪唑洗脫；M：分子量標準）]

Figure 1 Expression and purification results of GST-IBD and IN-HIS were detected by SDS-PAGE [A: GST-IBD (M: Marker;1: Supernatant; 2: After induction; 3: Before induction; 4: 20 mmol/L GSH elution); B: IN-HIS (1: Before induction; 2: After induction; 3: Supernatant; 4: 250 mmol/L imidazole elution; M: Marker)]

圖 2 HTRF 測試 GST-IBD 與 IN-HIS 相互作用方法評價結果

Figure 2 Evaluation results of GST-IBD and IN-HIS interaction by HTRF

2.4 BBP 庫中 IN-LEDGF/p75 抑制劑篩選結果

同樣，將 BBP 庫中 400 個化合物進行抑制 IN-LEDGF/p75 活性篩選，每個化合物初篩體系終濃度為 50 μmol/L，重復 2 次。初篩結果顯示，化合物根皮含柘樹呫噸酮 L（cudraxanthone L）與迷迭香酸（rosmarinic acid）對 IN-LEDGF/p75 抑制活性均達到 90% 以上。將這 2 個化合物在反應體系中的終濃度以 50 μmol/L 作為起始濃度進行倍比稀釋，測定 2 個化合物對 IN-LEDGF/p75 的抑制百分率，通過非線性擬合得出 2 個化合物對 IN-LEDGF/p75 抑制的 IC50值（圖 6 和圖 7）。結果顯示，根皮含柘樹呫噸酮 L 和迷迭香酸的 IC50值分別為 18.5 和 1.13 μmol/L。

圖 3 化合物腎上腺酮的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 3 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound adrenalone

圖 4 化合物6-溴-1，2-二氫萘-1，2-二酮的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 4 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound bonaphton

圖 5 化合物頭孢噻吩的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 5 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound cefalotin

圖 6 化合物根皮含柘樹呫噸酮 L 的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 6 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound cudraxanthone L

圖 7 化合物迷迭香酸的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 7 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound rosmarinic acid

3 討論

HIV-1 IN-LEDGF/p75 蛋白之間的相互作用對于 IN 進入細胞核以及染色體定位是必需的，是篩選抗病毒藥物的重要靶點[8]。晶體結構顯示，二聚化的整合酶 CCD 形成的結合口袋與 LEDGF/p75 的 IBD 發生了相互作用。研究表明，抑制 CCD-IBD 相互作用的小分子化合物也能夠抑制它們各自全長蛋白，即 IN 和 LEDGF/p75 之間的相互作用。因此，本文采用全長的 IN 與 IBD 之間的相互作用來進行 IN-LEDGF/p75 之間的相互作用篩選。

腎上腺酮是兩棲綱、爬行綱、鳥綱和哺乳類中的嚙齒目動物的主要糖皮質激素，具有調節應激反應、免疫反應的功能。此外，腎上腺酮還是目前公認的心臟復蘇首選藥的合成前體[11]。6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮是一種新的抗病毒化療藥物。研究表明，6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮能明顯降低鼻內接種 A2 型流感（香港）68 病毒的小鼠的嚴重致死率[12]。頭孢噻吩臨床上作為耐青霉素金葡菌（耐甲氧西林者除外）所致的呼吸道感染、軟組織感染、尿路感染、敗血癥等的選用藥物[13]，可用于 AIDS 引起的細菌感染。根皮含柘樹呫噸酮 L 為氧雜蒽酮類化合物，廣泛存在于一些天然中草藥中，具有利尿、抗微生物、抗病毒、強心、抗結核、抗癌、抗肝毒等藥理活性[14]。目前未見關于這 4 個化合物具有抑制 IN-LEDGF/p75 相互作用的活性的報道。因此，本研究首次報道了這 4 個化合物具有抑制IN-LEDGF/p75 相互作用的活性。

迷迭香酸廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物資源中，具有抗菌消炎、抑制 HIV 整合酶、抑制透明質酸酶、抗抑郁、抗血栓、抗腫瘤等藥理作用[15]。Tewtrakul 等[16]發現，提取于紫蘇的迷迭香酸在體外抑制 HIV-IN 活性的 IC50值為5 μmol/L，而本文發現迷迭香酸在體外抑制 IN-LEDGF/p75 相互作用的 IC50為 1.13 μmol/L，表明迷迭香酸是一種蛋白-蛋白相互作用抑制劑，為發現 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑提供了重要基礎。

[1] Gilbert PB, Mckeague IW, Eisen G, et al. Comparison of HIV-1 and HIV-2 infectivity from a prospective cohort study in Senegal. Stat Med, 2003, 22(4):573-593.

[2] Zhang X. Anti-retroviral drugs: current state and development in the next decade. Acta Pharm Sin B, 2018, 8(2):131-136.

[3] Dayam R, Al-Mawsawi LQ, Neamati DN. HIV-1 integrase inhibitors: an emerging clinical reality. Drugs R D, 2007, 8(3):155-168.

[4] Hazuda DJ. HIV integrase as a target for antiretroviral therapy. Curr Opin HIV AIDS, 2012, 7(5):383-389.

[5] Hazuda DJ, Felock P, Witmer M, et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells. Science, 2000, 287(5453):646-650.

[6] Métifiot M, Vandegraaff N, Maddali K, et al. Elvitegravir overcomes resistance to raltegravir induced by integrase mutation Y143. AIDS, 2011, 25(9):1175-1178.

[7] Van Maele B, Busschots K, Vandekerckhove L, et al. Cellular co-factors of HIV-1 integration. Trends Biochem Sci, 2006, 31(2):98- 105.

[8] Maertens G, Cherepanov P, Pluymers W, et al. LEDGF/p75 is essential for nuclear and chromosomal targeting of HIV-1 integrase in human cells. J Biol Chem, 2003, 278(35):33528-33539.

[9] De Rijck J, Vandekerckhove L, Gijsbers R, et al. Overexpression of the lens epithelium-derived growth factor/p75 integrase binding domain inhibits human immunodeficiency virus replication. J Virol, 2006, 80(23):11498-11509.

[10] Wang HJ, Zhou ZH, Xu JC, et al. HTRF-based method for determination of HSP90-HOP inhibition activity and its application. Acta Pharm Sinica, 2017, 52(4):592-597. (in Chinese)

王慧潔, 周子涵, 徐嘉辰, 等. 基于均相時間分辨熒光技術(HTRF)的HSP90-HOP相互作用抑制劑活性測試方法的構建及其應用. 藥學學報, 2017, 52(4):592-597.

[11] Fotopoulou MA, Ioannou PC. Post-column terbium complexation and sensitized fluorescence detection for the determination of norepinephrine, epinephrine and dopamine using high-performance liquid chromatography. Anal Chimica Acta, 2002, 462(2):179-185.

[12] Nikolaeva IS, Kutchak SN, Bogdanova NS, et al. Pathomorphological study of antiviral chemotherapeutic effectiveness of bonaphthon under experimental conditions. Farmakol Toksikol, 1976, 39(3):336-341.

[13] Carranza-Torres JM, Vargas-Daza ER, Villarreal-Ríos E, et al. Effectiveness of the scheme reimpregnation maintenance schedule vs. ceftazidime/cephalothin in dialysis patients with peritonitis. Nefrologia, 2016, 36(4):448-450.

[14] Lian SS. Research progress on xanthones. Guangdong Chem Ind, 2014, 41(2):46-47. (in Chinese)

連雙雙. 氧雜蒽酮類化合物的研究進展. 廣東化工, 2014, 41(2):46- 47.

[15] You R, Ma XQ, Wu BH, et al. Advance in pharmacological effects of Rosmarinic Acid. Sichuan J Physiol Sci, 2015, 37(2):93-96. (in Chinese)

尤茹, 馬雪倩, 吳炳火, 等. 迷迭香酸藥理作用研究進展. 四川生理科學雜志, 2015, 37(2):93-96.

[16] Tewtrakul S, Miyashiro H, Nakamura N, et al. HIV-1 integrase inhibitory substances from Coleus parvifolius. Phytother Res, 2003, 17(3):232-239.

Screening of inhibitors targeting HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction

XU Xiao-shuang, ZHANG Da-wei

Institute of Bioinformatics and Medical Engineering, Jiangsu University of Technology, Changzhou 213001, China

The protein-protein interaction between the cellular chromatin associated protein lens epithelium-derived growth factor (LEDGF/p75) and the HIV-1 integrase (IN) is an effective target for the development of anti-HIV-1 drugs. This work aims to find small molecular inhibitors targeting the HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction.

The inhibitory activity of 799 compounds (from 2 compounds libraries: InterBioScreen and BioBioPha) on the interaction of IN-LEDGF/p75 was screened by a homogeneous time resolved fluorescence (HTRF)-based assay.

It was found that five compounds, adrenalone, bonaphton, cefalotin, cudraxanthone L and rosmarinic acid, showed different inhibitory effect on the interaction of HIV-1 IN-LEDGF/p75, and their IC50values were 12.3, 22.7, 26.2, 18.5 and 1.13 μmol/L, respectively.

This work provides an important basis for the discovery of HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction inhibitors and the development of new anti-HIV-1 drugs.

HIV integrase; HIV integrase inhibitors; LEDGF/p75; Homogeneous time resolved fluorescence; Protein-protein interaction

ZHANG Da-wei, Email: zhangdw517@gmail.com

國家自然科學基金（31700297）

張大為，Email：zhangdw517@gmail.com

2018-07-09

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.003