平板培養結合宏測序法調查小麥田土壤真菌多樣性

馬樂樂 翟妮平 馬慶周 郭玉霞 耿月華 張猛

摘要：從河南省商丘市小麥田里于揚花期采集土樣3份，通過ITS2宏測序方法結合平板培養法研究了小麥揚花期田間真菌種類，發現小麥田塊物種多樣性指數明顯大于甜瓜地塊，平均有1 630個OTUS。培養法獲得的主要菌株為枝細枝孢（Cladosporium ramotenellum）、疣孢漆斑霉（Myrothecium verrucaria）和鏈格孢（Alternaria alternata），并對其形態進行詳盡的描述。

關鍵詞：土壤真菌；宏測序；枝細枝孢；疣孢漆斑霉；鏈格孢

中圖分類號：S154.38 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0119-04

Abstract Three soil samples were collected from wheat fields in Shangqiu City of Henan Province. The fungal species at the flowering stage of wheat were studies by ITS2 macro sequencing combined with plate culture method. The results showed that the species diversity index of wheat field was significantly greater than that of melon plots， for an average of 1 630 OTUS. The main strains obtained by culture were Cladosporium ramotenellum，Myrothecium verrucaria and Alternaria alternata， and their morphology was described in detail.

Keywords Soil fungi； Macro sequencing； Cladosporium ramotenellum； Myrothecium verrucaria； Alternaria alternata

河南是小麥種植大省，氣候處于亞熱帶溫帶過渡帶，四季分明，氣候非常適合小麥生長，同時建有國家糧庫，在國家糧食安全上起著舉足輕重的作用?，F在的主要種植制度為小麥和玉米輪作，這種輪作方式在土地利用上發揮了很好的時間優勢[1]。其中秸稈還田是該種植制度下的主要耕作方式，并且有諸多好處[2-5]。秸稈尤其玉米秸稈還田后長期不腐爛現象造成了很多病原菌的積累。土壤中的微生物是秸稈降解的主要參與者，但冬小麥和夏玉米輪作體系下的土壤絲孢真菌物種多樣性至今未有系統報道，本研究通過宏條形碼技術結合平板培養法對冬小麥和夏玉米輪作體系下土壤真菌的多樣性進行研究。

1 材料與方法

2017年4月在河南省商丘市采集多年小麥玉米輪作田塊土樣3份，編號為SQ425-1、SQ-2、SQ-3，另外采集一份甜瓜田塊土樣ZKG-1做對照，進行室內分離培養和ITS2宏測序分析。

可培養絲孢菌的研究方法：采用TWA稀釋平板法處理土壤樣品標本，然后進行單孢分離獲取目的菌株，進行菌株保存和鑒定描述，詳細方法見參考文獻[6]。

免培養法研究菌種多樣性：采用試劑盒（MP Biomedicals， Solon， OH， USA）法提取土壤總DNA。用引物ITS3F （5′-GCATCGATGAAGAAC

GCAGC-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGA

TATGC-3′） 擴增ITS2片段。PCR反應體系為：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環；72℃ 7 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂凝膠電泳檢測，所得產物經PCR產物純化試劑盒進行回收，送至上海生工生物技術有限公司進行測序，利用數據庫FLASH、QIIME、UNITE和INSDC分析土壤中真菌物種多樣性。

2 結果與分析

2.1 宏測序結果

通過 ITS3F和ITS4引物對ITS2進行宏測序，獲得序列片段大小約320 bp，小麥土壤樣品（SQ425-1、SQ-2、SQ-3）序列分別為57 861、55 367條和49 624條，平均54 284條，獲取的OTUS分別為1 824、1 380個和1 688個，平均為1 630個，對照組瓜田（ZKG-1）OTUS為1 273個（表1）。小麥田中的Shannon指數明顯大于瓜田且三塊小麥田的重復性較好，可見瓜田的物種多樣性指數明顯低于小麥田塊，同時小麥田的Simpson指數遠遠小于瓜田土壤，同樣反映了小麥田塊真菌的物種多樣性指數明顯較高。

通過樣品的OTUS聚類樹（圖1）可見，三個小麥重復樣品能很好地與瓜田土樣分開。在宏測序中獲得較多的OTUS為未分類群（unclassified），說明大多數宏測序得到的結果未能在數據庫匹配上具體的物種。獲得較多的菌種有鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、青霉屬（Penicillium）、腐質霉屬（Humicola）和尾孢屬（Cercozoa），但是沒有檢測到漆斑霉（Myrothecium）。通過韋恩圖（圖2）可以看出，4份土樣中都有的OTUS有79個，而瓜田特有的有1 040個。

2.2 可培養真菌的形態學觀察

獲得的可培養真菌主要是枝細枝孢、疣孢漆斑霉和鏈格孢。

枝細枝孢在PDA培養基上菌落平展，絨狀，暗綠色。培養兩周后菌落直徑3 cm。菌絲近無色至淡褐色，有隔膜，光滑或密布小疣，偶分枝菌絲寬1.5～3.5 μm。分生孢子梗單生且間生或頂生于菌絲上，無色或淡褐色細線或闊線型，偶有分枝，直或者彎曲，不呈屈膝或“Z”字形彎曲（圖3）。產孢細胞頂生或側生，圓柱形。分生孢子間生或頂生，孢子鏈分枝；頂生的小孢子為單生球形或卵球形，大小3～5.5 μm×2～3 μm；間生的分生孢子圓柱形或橢圓形，無隔膜或一個隔膜，大小4～14 μm×3～4 μm；次級枝孢為圓柱形，0～2個隔膜，分隔處孢臍明顯。

疣孢漆斑霉菌落平整，初白色，后漸變為灰色，呈絨毛狀或疏松棉絮狀。生長速度中等，25℃PDA培養基上培養14 d菌落直徑達3 ～ 8.5 cm，培養基背面淡褐色或灰白色。菌絲體部分表生，部分埋生。菌絲光滑，有隔膜，無色或淡褐色，分枝，有時形成菌絲束，寬1.5～3 μm。產孢梗為單線形，具隔膜，端部分枝多呈青霉狀排列，近無色。產孢瓶體光滑，淡橄欖褐色，頂端明顯乳頭狀突出，無隔膜，大小4.5～21 μm×1.5～3 μm。分生孢子舟形、檸檬形，兩端尖細，基部半截，有時可見1～2個油滴，淡褐色，聚集在一起常為中等褐色或綠色，大小5.5～7.5 μm×2～3 μm（圖4）。

鏈格孢菌落平整，棉絮狀或絨狀，常為灰色及灰褐色，等徑生長，速度中等，在25℃環境下PCA培養基上培養14 d菌落直徑達3～6.5 cm。菌絲體淡褐色或無色，表生或埋生，有隔膜且常有分枝。分生孢子梗單生或簇生，直立或膝狀折曲（圖5）。分生孢子（孔出孢子）倒棍棒形、橢圓形，多胞，具有橫縱膈膜，暗色，鏈生或單生，孢子大小12～41 μm×7～14 μm，喙胞短或長，長喙有的一次分枝，具隔膜，淺色或無色。

3 討論與結論

宏條形碼技術是基于1998年Handelsman提出宏基因組學的方法而快速發展起來的新技術[7]，可以快速高效檢測土壤中的微生物動態變化，也是真菌檢測方面常用的免培養方法。2011年，Mendes等[8]基于微矩陣芯片的宏條形碼技術和可培養功能分析方法研究了抑病土壤的根際微生物群落，發現變形菌門、厚壁菌門和放線菌門與疾病的抑制有關。2014年，Tedersoo等[9]獲取了全球365個土壤樣品的真菌ITS序列，發現氣候因子對土壤真菌的物種豐富度和群落組成影響最大，并直接或間接通過土壤和植物等因素的變化影響土壤真菌多樣性?，F在真菌宏條形碼技術一般通過ITS2片段測序進行分析。本研究通過培養計數方法發現排在前三名的真菌為枝細枝孢、疣孢漆斑霉和鏈格孢，均為腐生性，容易在培養基上生長。不過鏈格孢是很多葉斑病的病原菌，更多情況是在病害發生后期復合侵染[10-12]。

對于小麥常見重要病原菌的測定，宏測序結果不太理想，有少量的鐮刀菌，但是沒有Bipolaris菌種，而前人在該時期小麥土壤中發現較多的Bipolaris菌。鐮刀菌是重要的小麥病原菌，尤其赤霉病危害嚴重[13-16]，但是在ITS2的宏測序中并沒有發現這個特點，可能是由于目的片段太短，所以不能確定到種。本方法中能夠獲得兩屬的部分菌株，但生長量不多。ITS是重要的真菌分子鑒定條形碼，通過宏測序ITS1或者ITS2，得到300 bp左右的片段，在鑒定上很難達到物種水平。這兩個方法暫時很難統一起來，所具有的數據也不在一個數量級別，以后還要在宏測序上繼續擴大測序片段以求鑒定到種的級別。

小麥是我國重要的糧食作物，目前尚未有對其土壤真菌物種資源多樣性的系統研究，而對其資源的挖掘將為病害綠色防控、秸稈降解奠定重要資源基礎。

參 考 文 獻：

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