多粘類芽孢桿菌脂肽類抗生素合成與分泌機制研究進展

汪城墻 戴莉 劉凱 杜秉海 丁延芹

摘要：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是一種常見的植物根際促生細菌，對植物具有直接或間接生防作用，已在控制農(nóng)業(yè)病害、促進作物生長等方面廣泛應用。其可抑制植物病原菌，主要通過產(chǎn)生多粘菌素、殺鐮刀菌素等脂肽類抗生素發(fā)揮作用。關于多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗生素合成和分泌等促生相關分子機制的研究具有重要理論和應用價值。本研究綜述了多粘類芽孢桿菌的分子遺傳操作體系，多粘菌素和殺鐮刀菌素合成基因簇的鑒定、表達調(diào)控基因的分析和分泌機制，并從脂肽類抗生素合成和分泌機制角度展望其今后的研究趨勢。

關鍵詞：多粘類芽孢桿菌；植物根際促生細菌；多粘菌素；殺鐮刀菌素；分子機制；外排蛋白

中圖分類號：S476.19 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0157-07

Abstract Paenibacillus polymyxa is a common plant growth-promoting bacterium that have direct or indirect synergistic effects. It has been widely used in controlling agricultural diseases and promoting crop growth. P. polymyxa can inhibit some plant pathogens mainly through the production of polymyxin， fusaricidins and other lipopeptide antibiotics. The study on the molecular mechanisms of the lipopeptide antibiotics production and secretion in P. polymyxa has important theoretical and practical value. In this review，we summarized the molecular genetic system of P. polymyxa， and the gene cluster identification， the analysis of regulation genes and the secretion mechanisms of polymyxin and fusaricidins. At last， we proposed the prospect of the mechanism of lipopeptide antibiotics synthesis and secretion.

Keywords Paenibacillus polymyxa； Plant growth-promoting rhizobacteria； Polymyxin； Fusaricidins； Molecular mechanism； Efflux transporter

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大量化學農(nóng)藥和肥料的使用雖然增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)值，同時也造成了土壤酸化板結、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留等環(huán)境和食品健康問題，嚴重影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，開發(fā)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥和肥料就顯得尤為重要。植物根際促生細菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）是一類生活在植物根際土壤或附生于植物根部的可直接或間接促進植物生長、增強植物對逆境脅迫抵抗力的微生物，在生物農(nóng)藥和肥料研制和生產(chǎn)過程中具有重要價值[1，2]。

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是一類具有防病促生作用的PGPR，為營兼性厭氧，可形成芽孢的低GC含量革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于作物根際土壤，對多種作物土傳病害具有顯著防治效果[2]，并可誘導植物系統(tǒng)抗性，是微生物醫(yī)藥、微生物環(huán)境修復、微生物農(nóng)藥和肥料研發(fā)領域非常重要的菌種資源[3]。多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如抗菌物質(zhì)、植物激素、胞外多糖、多功能水解酶等，其中，通過非核糖體肽途徑由非核糖體肽合成酶（NRPS）合成脂肽類抗生素是多粘類芽孢桿菌發(fā)揮生防功能的重要渠道之一[4-6]。截至目前，國內(nèi)外學者已進行了30株多粘類芽孢桿菌的基因組測序，其中有10株獲得了全基因組序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Paenibacillus+polymyxa），并發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌普遍含有脂肽類抗生素的合成和分泌基因[7]。大多數(shù)多粘類芽孢桿菌主要產(chǎn)生兩種脂肽類抗生素，一類主要為多粘菌素（polymyxin）、粘菌素、環(huán)桿菌素等，只對細菌（主要是革蘭氏陰性細菌）有抑制作用；另一類為殺鐮刀菌素（fusaricidins）、多肽菌素等，對真菌和革蘭氏陽性細菌均有抑制活性[4-6]。限制多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生脂肽類抗生素的因素主要有胞內(nèi)合成能力和向胞外的分泌能力。為了提高多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗生素合成能力，大量研究已致力于培養(yǎng)條件等體外因素的優(yōu)化以及對其合成基因簇的鑒定、結構改造[8，9]，探索其合成和分泌途徑中的分子機制。多粘類芽孢桿菌也是類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）的模式生物，對研究和解析這一類微生物的功能具有重要價值。利用多粘類芽孢桿菌作為生產(chǎn)抗生素的細胞工廠，借助合成生物學工具，也可研發(fā)和合成新型或混合型抗生素，增強應用效果并提高使用安全性[10]。

本研究綜述了國內(nèi)外多粘類芽孢桿菌的分子遺傳操作體系及其兩種酯肽類抗生素產(chǎn)物多粘菌素、殺鐮刀菌素合成基因簇的鑒定、表達調(diào)控基因的分析和分泌機制的進展，并展望了后續(xù)多粘類芽孢桿菌的分子機制研究趨勢。

1 多粘類芽孢桿菌遺傳操作體系的建立與優(yōu)化 方便高效的遺傳操作體系是研究多粘類芽孢桿菌合成和分泌脂肽類抗生素機制的基礎。近年來，隨著多粘類芽孢桿菌分子機制研究的深入，不同的研究團隊在多粘類芽孢桿菌中已建立多種分子遺傳操作體系，確保了基因功能研究和工程菌改造的可行性。

1.1 敲除體系的建立與比較分析

研究人員在多粘類芽孢桿菌中已先后構建了多種基因敲除體系。早期，通過構建攜帶篩選標記（如奇霉素、四環(huán)素、卡那霉素抗性標記等）的Cosmid或Fosmid基因組文庫，借助λ-Red重組系統(tǒng)，在多粘類芽孢桿菌中成功敲除了fusA、pmxC、pmxD和pmxE等多種基因[11-15]。Li等[8，16]進一步借助Cre-LoxP體系在多粘類芽孢桿菌中構建了多基因連續(xù)無痕敲除系統(tǒng)，并實現(xiàn)了在一個細胞株內(nèi)多個基因的連續(xù)敲除。目前，多粘類芽孢桿菌中比較常用的一種簡化了的基因敲除方法是應用自殺性質(zhì)粒。Kim等[11]使用變性的自殺質(zhì)粒pGEM7Z-f+作為載體，以α-和β-淀粉酶為目標基因，分別以氯霉素和紅霉素抗性盒作為篩選標記，在多粘類芽孢桿菌E681菌株中成功建立了簡化的基因敲除系統(tǒng)。本課題組用在革蘭氏陽性細菌和大腸桿菌中復制的溫敏型自殺質(zhì)粒pRN5101為載體，以pmxE和spo0A為目標基因，以氯霉素抗性盒作為整合篩選標記，紅霉素作為去除質(zhì)粒篩選標記，在多粘類芽孢桿菌SC2中亦成功建立了相似的基因敲除系統(tǒng)[17，18]。

1.2 超表達體系的初步探索

目前，在多粘類芽孢桿菌中僅開展了個別基因的回補表達驗證工作[8，13，17]，基因超表達體系尚不完善，還不能對基因進行不同強度的精準控制。Kim等曾嘗試使用大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pHPs9 表達α-和β-淀粉酶，僅部分回補了α-和β-淀粉酶缺失菌株的酶活力，分析原因是啟動子p59的啟動效果不充分造成的[11]；隨后，Kim等優(yōu)化了回補方法：從質(zhì)粒pHcMc05上克隆得到1.7 kb片段，包含Pspac promoter和lacI 基因，同樣連接至質(zhì)粒pHPs9中，得到IPTG誘導的pHPspac附加體質(zhì)粒，成功用于E681的基因PPE00036、PPE01127、PPE01377和PPE04441的回補驗證[15]。2013年，Li等[8]基于大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pUBC19，構建了可在多粘類芽孢桿菌SQR-21中存在的附加體質(zhì)粒，以gfp為報告基因，研究了不同長度的fusA基因簇啟動子的啟動能力。多粘類芽孢桿菌是天然高效生產(chǎn)光學純R，R-2，3-丁二醇的微生物，相關代謝合成研究較多，使用的啟動子（如P43啟動子）和表達載體一般來自枯草芽孢桿菌[19]。另外，Brito等[20]發(fā)現(xiàn)三個組成型異源啟動子Ppyk、Pgap和Ptuf在多粘類芽孢桿菌中可以有效表達。由于在多粘類芽孢桿菌中尚缺乏完善的超表達體系，本課題組基于枯草芽孢桿菌表達載體pHY300PLK，使用gfp作為報告基因，在多粘類芽孢桿菌SC2中構建了啟動子捕獲載體，通過對多粘類芽孢桿菌SC2的基因組文庫篩選內(nèi)源性啟動子，旨在建立內(nèi)源啟動子庫并完善多粘類芽孢桿菌的基因表達系統(tǒng)（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

1.3 轉(zhuǎn)化方法的研究

對從自然界中分離篩選到的野生型芽孢桿菌進行基因轉(zhuǎn)化一般比較困難，再加上外源質(zhì)粒的不相容性，嚴重限制了芽孢桿菌的基因工程改造。而多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生大量的胞外多糖，使基因轉(zhuǎn)化比一般的芽孢桿菌更加困難。但經(jīng)過國內(nèi)外不同研究團隊的不懈努力，通過優(yōu)化一些芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法，在多粘類芽孢桿菌中已成功建立了轉(zhuǎn)化體系，主要有電擊轉(zhuǎn)化、屬間接合轉(zhuǎn)移和堿金屬離子轉(zhuǎn)化[12， 15]。電擊轉(zhuǎn)化法廣泛應用于革蘭氏陽性細菌中，是目前多粘類芽孢桿菌中使用最為廣泛的轉(zhuǎn)化方法。本課題組使用該法在多粘類芽孢桿菌SC2中實現(xiàn)了多種質(zhì)粒的較高效率轉(zhuǎn)化[17]。近來，一個簡單、便宜并且高效的細菌轉(zhuǎn)化方法在多粘類芽孢桿菌中成功建立，此方法基于magnesium aminoclays結合質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌，可以高效率地進行遺傳轉(zhuǎn)化[20，21]。本課題組發(fā)現(xiàn)此方法可實現(xiàn)野生型多粘類芽孢桿菌SC2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，具有較大的應用前景。

2 多粘類芽孢桿菌的多粘菌素合成分子機制 多粘菌素被譽為防御革蘭氏陰性病原菌的最后防線——超級藥物，可直接裂解陰性菌細胞膜、融合內(nèi)外層膜造成滲透脅迫并能夠通過羥基自由基和氧化脅迫誘導細菌死亡[9，22]。近十年，大量研究集中在研發(fā)新型多粘菌素，降低副作用，提高應用安全性方面[10]。利用多粘類芽孢桿菌作為細胞工廠，對多粘菌素的化學結構進行分析和改造的研究也已開展多年，這為分泌途徑中跨膜轉(zhuǎn)運過程的研究提供了多粘菌素分子結構基礎。

多粘菌素是由10個氨基酸組成的多肽（圖1A），第10位的氨基酸L-Thr和第4位的2，4-二氨基丁酸（L-Dab）環(huán)化形成一個七肽環(huán)，氨基端被脂肪酸修飾（FA）。肽鏈中第3、6、7位氨基酸可變[13，24]，產(chǎn)生多粘菌素A、B、C、D、E等多種類型，其中，多粘菌素B和E已廣泛應用于臨床。多粘類芽孢桿菌具有保守的多粘菌素合成基因簇，但合成的多粘菌素類型差別較大。先后有不同的課題組對多粘類芽孢桿菌E681[24]、PKB1[13]、M-1[25]和SC2[26]等的多粘菌素合成基因簇進行鑒定和分析，多粘菌素合成基因簇pmx（圖2A）組成為pmxA、B、C、D、E，其中pmxE、A、B三個基因直接編碼合成多粘菌素的NRPS，pmxC、D兩個基因編碼ABC型分泌蛋白[24]。多粘菌素由NRPS直接識別4種前體氨基酸L-Dab、L-Leu、L-Thr和D-Leu并連接成多肽鏈的方式合成，然后通過分泌途徑，借助于細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白出胞。NRPS是具有模塊組件的合成酶，其模塊的數(shù)量和排列順序直接對應合成多肽的一級序列，對其模塊的分子改造亦可產(chǎn)生不同活性的多粘菌素[23， 25]。Niu等[25]證明polymyxin P是M-1菌株抑制病原菌Erwinia spp. 的成分，包括 polymyxin P1和polymyxin P2兩種組分。Shaheen等[13]鑒定了PKB1菌株的相應NRPS合成模塊，證實其可產(chǎn)生兩種新的多粘菌素B。

多種內(nèi)源基因在多粘類芽孢桿菌合成多粘菌素過程中起到重要調(diào)控作用。多粘菌素B硫酯酶和spo0A等基因?qū)Χ嗾尘谺最終完整活性結構的形成起到重要的正調(diào)控作用[27]；一定高濃度前體氨基酸的存在會通過抑制多粘類芽孢桿菌內(nèi)源多粘菌素E合成基因（如ectB、pmxA、pmxE等）的表達，從而抑制多粘菌素E的合成[28]；abrB轉(zhuǎn)錄因子可直接與pmxA的上游區(qū)域結合，直接抑制多粘菌素合成基因的轉(zhuǎn)錄[29]。目前，對多粘類芽孢桿菌的多粘菌素合成調(diào)控分子機制的解析，正在逐步深入開展。

3 多粘類芽孢桿菌的殺鐮刀菌素合成分子機制 多粘類芽孢桿菌主要通過產(chǎn)生殺鐮刀菌素殺除或抑制作物病原真菌（如：尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、黑曲霉Aspergillus niger等）和革蘭氏陽性細菌（如：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus等）[4，5]。關于多粘類芽孢桿菌的殺鐮刀菌素合成基因簇的解析、應用和化學結構分析研究已開展多年，現(xiàn)已明確殺鐮刀菌素的分子結構基礎。

多粘類芽孢桿菌的殺鐮刀菌素合成基因簇比較保守，但類型卻各有不同[30，31]。殺鐮刀菌素的完整fus基因簇（圖2B）包括10個基因[8]，其NRPS由其中的fusA基因直接編碼，含有6個模塊；殺鐮刀菌素是含有6個氨基酸和一個2-胍基-3-羥基十五烷酸（GHPD）的環(huán)狀多肽類抗生素（圖1B），N端L-Thr1和C端D-Ala通過酯鍵相連成環(huán)，肽鏈中主要有3個可變位置，這些位置氨基酸殘基的不同引起抗菌活性的差異[14]。

2009年人們正式開啟了殺鐮刀菌素合成過程的分子調(diào)控機制研究[4，32]，多種基因和化合物可顯著影響多粘類芽孢桿菌的殺鐮刀菌素合成。一定濃度的金屬離子Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+等可以顯著提高fusA基因的RNA表達量，提高殺鐮刀菌素的合成能力[33，34]。Kim等[15]對菌株E681誘變篩選，分析并證明葡糖磷酸變位酶基因pgm的失活可以提高E681的殺鐮刀菌素合成能力。而Li等[8]克隆并研究了fus基因簇的啟動子區(qū)域，證實全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子abrB可以通過接合在啟動子區(qū)域降低SQR-21的殺鐮刀菌素合成能力。Li等[35]通過在大腸桿菌中異源表達多粘類芽孢桿菌PKB1的殺鐮刀菌素合成酶的第六模塊，證實此腺苷酰化結構域可特異性識別和激活D-Ala；PKB1的殺鐮刀菌素合成過程中，D-型氨基酸被直接激活，說明此多肽合成酶可以直接識別 D-Ala。本課題組在研究中也發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌SC2的菌落分化現(xiàn)象突出，并伴隨著殺鐮刀菌素分泌量的變化，但尚不清楚多粘類芽孢桿菌的分化機制，其與脂肽類抗生素合成的相互關系也有待于進一步驗證[17]。

4 多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗生素分泌機制 多粘類芽孢桿菌胞內(nèi)合成脂肽類抗生素后需要盡快排出，否則會對細胞自身造成一定損傷。多粘類芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性細菌，革蘭氏陽性細菌普遍含有的外排途徑有Sec分泌途徑、Tat分泌途徑、ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter）分泌途徑以及其它特殊途徑[37，38]。

多粘類芽孢桿菌中脂肽類抗生素外排蛋白的研究中，敲除兩個ABC型轉(zhuǎn)運蛋白基因pmxC或pmxD，可顯著降低多粘類芽孢桿菌PKB1對多粘菌素以及殺鐮孢菌素的分泌量，pmxC比pmxD作用更顯著[13]，即證實了ABC型轉(zhuǎn)運蛋白對脂肽類抗生素分泌的重要作用，以及分泌過程的非專一性。本課題組對辣椒根際互作培養(yǎng)的多粘類芽孢桿菌SC2（可高產(chǎn)多粘菌素）的轉(zhuǎn)錄組測試，以及一株經(jīng)ARTP誘變獲得的不產(chǎn)多粘菌素的突變株的轉(zhuǎn)錄組測序結果進行比較后發(fā)現(xiàn)，大量ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的表達差異顯著，并和多粘菌素產(chǎn)量有很強的相關性，并且ABC型外排蛋白對多粘菌素的分泌起到了重要作用。在革蘭氏陽性細菌中，ABC型轉(zhuǎn)運蛋白是分泌抗菌肽的重要膜蛋白[37]，外排型ABC轉(zhuǎn)運蛋白包括兩個疏水的跨膜結構域（TMD）和兩個親水的核苷酸結合域（NBD）（圖3）；一般一個基因同時編碼有一個TMD和一個NBD，組合成同型二聚體形式的完整ABC外排蛋白；若兩個不同基因編碼的TMD和NBD組合，可組成異型二聚體型ABC外排蛋白[38]。我們推測，pmx基因簇中的兩個ABC分泌蛋白pmxC和pmxD組合成異型二聚體。TMDs構成跨膜孔道，通過改變構象識別和輸送底物，序列變異較大；而NBDs含有高度保守的序列，可定位在細胞質(zhì)膜表面，通過水解ATP提供能量行使轉(zhuǎn)運[37]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白分泌途徑除了可轉(zhuǎn)運抗菌肽類物質(zhì)，還可轉(zhuǎn)運氨基酸、多糖等多種物質(zhì)。雖然多粘類芽孢桿菌中脂肽類抗生素ABC外排蛋白的結構尚未解析，但通過近緣ABC外排蛋白的晶體結構[38]可推測其結構，為研究多粘菌素的外排轉(zhuǎn)運機制提供結構基礎。目前，對革蘭氏陰性病原菌的多粘菌素耐藥機制研究較多，外排蛋白對多粘菌素的外排作用是機制之一，如外派泵AcrAB和KpnEF在克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）的多粘菌素抗性方面具有重要作用[39]。一些針對外排轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸突變工作，可以識別轉(zhuǎn)運關鍵位點，同時也有助于增強分泌能力，揭示重要分泌機制[40]，多粘菌素的跨膜分泌機制需要進一步揭示。

5 總結與展望

近年來，多粘類芽孢桿菌除了在醫(yī)學上廣泛使用之外，作為拮抗細菌的篩選研究工作在國內(nèi)外也已取得較大進展，是生產(chǎn)生物農(nóng)藥和生物肥料的重要菌種。其重要的生物活性成分多粘菌素和殺鐮刀菌素等脂肽類抗生素的基因簇鑒定、分子結構解析、合成調(diào)控過程以及分泌途徑的研究，有助于增強多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗生素合成和分泌能力，增強菌株應用效果，為開展代謝工程與合成生物學研究及構建高效工程菌株奠定基礎。目前，多粘類芽孢桿菌的脂肽類抗生素的合成調(diào)控機制尚未完全解析，如精確起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子有哪些？它們之間是如何協(xié)作的？與初級代謝合成的轉(zhuǎn)換開關是什么？合成后與跨膜分泌途徑的識別和動力機制更有待于進一步深入開展。尤其尚需深入鑒定多粘類芽孢桿菌分泌脂肽類抗生素的ABC轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)。同時，是否存在其他高效率的非特異性ABC外排蛋白？識別和轉(zhuǎn)運多粘菌素過程中，ABC外排蛋白的哪些功能位點在起作用？另外，在多粘類芽孢桿菌和病原菌以及不同作物的互作過程中，感知外界信號的基因以及開啟脂肽類抗生素大量合成的基因通路有待于進一步揭示。

參 考 文 獻：

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