生防酵母菌株的分離篩選及其防治蘋果果實輪紋病效果

戴忠良 高克祥

摘要：為有效防控采后蘋果果實輪紋病，從泰安市三地果園不同果樹的葉片和果實中分離出30株酵母菌，分別進行離體抑菌活性測定和活體防病效果篩選，其中4株酵母菌抑菌活性較強，對4株酵母菌不同處理液對病原菌生長的影響、不同濃度下的防治效果及在蘋果果實上的生長定殖動態等進行了研究。結果表明：酵母菌株H3、T2、T3、Z8對蘋果輪紋病菌抑菌作用較強，第8 d的抑菌率分別為91.46%、91.06%、77.20%、88.66%。接種濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌7 d后，其防病效果分別是65.1%、82.5%、69.8%、84.1%。培養原液和菌懸液對病原菌抑制作用較強，菌落平均直徑小于4 cm。顯微鏡觀察發現只有菌株T3具有重寄生作用。酵母菌與病菌菌絲共培養試驗中，酵母菌對菌絲生長量的抑制率都在99%以上。酵母菌濃度越高，防病效果越好，其中菌株Z8的防治效果達到59.4%。4株酵母菌在YPD培養基和蘋果傷口中呈指數型增長，在YPD培養基中24 h達到峰值，在蘋果傷口上48 h達到峰值。經形態學和分子生物學初步鑒定，4株酵母菌均屬于季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

關鍵詞：酵母菌；果蔬采后病害；蘋果果實輪紋病；拮抗作用；生物防治

中圖分類號：S436.611.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0102-07

Abstract In order to prevent and control apple fruit ring rot effectively， 30 yeast strains were isolated from the leaves and fruits in three orchards in Taian. Their inhibition activity and disease prevention effects were screened in vivo， and four strains were selected with stronger bacteriostasis.The effects of different treatment solutions of the four yeast strains on the growth of pathogen， the control effect of different concentrations and the growth and colonization on apple fruit were studied. The results showed that the yeast strains H3， T2， T3 and Z8 had stronger inhibition against pathogen of apple fruit ring rot， and their inhibition rates were 91.46%， 91.06%， 77.20% and 88.66%， respectively. After inoculation with 1×108 cfu/mL yeast for 7 d， the disease control effect was 65.1%， 82.5%， 69.8% and 84.1%， respectively. The inhibitory effect of yeast culture solution and yeast cell suspension on pathogens was stronger， and the average diameter of colonies was less than 4 cm. Microscopic observation showed that only strain T3 had mycoparasitism. In the co-culture experiment of yeast and pathogen mycelium， the inhibition rate of yeast to mycelia growth was over 99%. The higher the yeast concentration， the better the disease control effect and the control effect of strain Z8 reached 59.4%. The concentration of the 4 yeast strains increased exponentially in YPD medium and apple wounds. The peak reached after 24 h in YPD medium， and 48 h on apple wound. According to morphological and molecular biology， the 4 yeast strains were preliminarily identified as Meyerozyma guilliermondii.

Keywords Yeast； Postharvest diseases of fruits and vegetables； Apple fruit ring rot； Antagonism； Biocontrol

果蔬采后病害造成的經濟損失巨大，目前主要防治方法是使用化學殺菌劑，但化學方法存在增強病原菌抗藥性、危害環境和人體健康等問題。生物防治具有長效、環保、安全的特點，逐漸受到人們青睞。研究結果表明，對果蔬采后病害有生防作用的微生物有細菌、霉菌和酵母菌等[1]。其中酵母菌具有拮抗效果好、安全、抗逆性強、繁殖速度快、遺傳穩定等優點，逐漸成為研究熱點?，F已報道的對果蔬采后病害具有明顯抑菌作用的酵母菌有20多種，例如隱球酵母屬的Cryptococcus infirmo-miniatus、羅倫隱球酵母（C. laurentii）和紅酵母屬的粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）對梨病害有較好的抑菌效果，C. infirmo-miniatus和粘紅酵母在采收前一天對梨進行處理，能有效控制梨的采后腐爛[2]；Mercier等[3]的研究發現，季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii）對由灰葡萄孢霉及黑曲霉引起的葡萄腐爛具有明顯的抑制效果，與只接種病菌的對照相比，分別可以減少16.81%和60.00%的腐爛損失。

富士蘋果對輪紋病菌高度感病，尤其在膠東半島、華北等中部高溫多雨地區發生普遍[4]。蘋果輪紋病既可以危害枝干，又可以直接侵染果實甚至潛伏至儲藏期危害采后果實。蘋果果實往往從接近成熟時開始發病，可持續至儲藏期，嚴重年份蘋果果實損失超過70%。蘋果輪紋病已成為重要的采后病害，給蘋果采后儲藏造成巨大的經濟損失[5]。因此，迫切需要研究安全有效的生物防治方法。

本試驗的目的主要是篩選對蘋果果實輪紋病有開發應用潛力的拮抗酵母菌株，研究不同酵母菌處理液對病原菌生長的影響、不同濃度酵母菌對蘋果輪紋病的防治效果、酵母菌在蘋果果實上的生長定殖動態等，以期為拮抗酵母菌在防治果蔬采后病害中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌菌株

蘋果果實輪紋病菌[貝倫格葡萄座腔菌（Botryosphaeria berengeriana）]為本實驗室保存菌種。

1.2 供試蘋果

供試蘋果采購于泰安市水果批發市場。選擇無病害、無傷口、成熟度和大小一致的富士蘋果，0℃下貯藏，備用。

1.3 酵母菌的分離與純化

1.3.1 樣本的采集 2016年9—10月分別從山東農業大學南校植保試驗站、山東省泰安市省莊鎮許家埠村、泰安市道朗鎮玄家莊村采集蘋果、桃、柿子、棗、海棠等的果實、葉片和土壤樣品。采樣方法：①果實樣品：不同地點隨機取樣，分別取健康和有傷口的果實兩種，裝入塑料袋內并標記時間、地點和品種。②葉片樣品：不同地點隨機剪取葉片，裝入塑料袋內，標記時間、地點和品種。③土壤樣品：在樹冠滴水線處，用取樣鏟將表層5 cm左右的浮土除去，取5～15 cm處的土樣約10～20 g，裝入樣品袋并標記地點、時間及環境條件。樣品取回后，及時晾干。壓碎后過孔徑為0.6 mm篩，備用。

1.3.2 酵母菌的分離與純化 ①表面分離法：參考Janisiewicz 等[6]的方法，取每個品種果實數個于大燒杯中，加入適量濃度為0.05 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液，100 r/min振蕩10 min。棄去洗液，再將果實放入磷酸緩沖液中，用超聲波清洗30 min，取洗液。將洗液梯度稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6，各取100 μL分別涂布于PDA 培養基上，25℃培養2～3 d，挑取單菌落在新PDA平板上劃線，2 d后進行鏡檢，對酵母或類似酵母的單菌落進行單細胞純化培養。葉片樣品同樣采用表面分離法。②土壤梯度稀釋分離法：參照方中達[7]的方法，稱取研細的土樣5 g，加入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩10 min，制成1∶ 10濃度的土壤懸浮液。待土粒沉淀后，將土壤懸浮液梯度稀釋成10-3、10-4、10-5，各取100 μL分別于PDA培養基上涂布，25℃培養2～3 d，挑取單菌落在新PDA平板上劃線，2 d后進行鏡檢，對酵母或類似酵母的單菌落進行單細胞純化培養。

1.3.3 培養基 ①PDB培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL，自然pH。如制固體培養基加入20 g瓊脂。121℃高溫高壓蒸汽滅菌25 min。②YPD培養基：A液：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，加水定容至900 mL，自然pH。B液：葡萄糖20 g，加水定容至100 mL，自然pH。121℃高溫高壓蒸汽滅菌25 min。A液∶ B液=9∶ 1混合均勻使用。

1.4 酵母菌株離體抑菌與活體防病試驗

1.4.1 酵母菌懸液的制備 將已純化的酵母菌接種在YPD培養基中，28℃、180 r/min振蕩培養48 h。將培養好的菌液6 000 r/min離心10 min，棄上清，無菌水反復清洗離心3次（去除培養基），用血球計數板計數并配成濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液，備用。

1.4.2 離體抑菌試驗 取100 μL濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液均勻涂布在PDA平板上，在PDA平板中心放置培養5 d、直徑為4 mm的病原菌菌餅，25℃恒溫培養，每天觀察菌絲生長情況。4 d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑。每處理重復3次，無菌水處理作為對照。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100 。

1.4.3 活體防病試驗 選取無病、無傷口、成熟度和大小一致的富士蘋果，用2%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，自來水沖洗干凈，自然晾干，備用。在果實的腰部用消毒的打孔器打3個直徑和深度為4 mm的傷口，向每個傷口中注入30 μL濃度為1×108 cfu/mL的酵母菌懸液。取一塑料盒，在塑料盒底部鋪滿一層衛生紙，倒入滅菌水，然后在衛生紙上面緊密地放滿一層培養皿（防止蘋果直接接觸水，加速腐爛），將處理的蘋果放到培養皿上，保鮮膜覆蓋塑料盒進行保濕，25℃恒溫培養。24 h后，將病原菌菌餅接種到傷口中，繼續25℃恒溫培養，每天觀察并拍照，第7 d統計發病率、病情指數和相對防治效果。每處理重復3次，每重復6個果實，無菌水處理作為對照。蘋果果實輪紋病害分級標準：0級，果實病斑直徑0～1 cm；1級，果實病斑直徑>1～2 cm；2級，果實病斑直徑>2～3 cm；3級，果實病斑直徑>3～4 cm；4級，果實病斑直徑>4～5 cm；5級，果實病斑直徑>5～6 cm。

病情指數=∑（各級病斑數×各級代表值）/（調查病斑總數×最高級別代表的數值）×100 。

防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100 。

1.5 不同酵母菌處理液對病原菌生長的影響

1.5.1 酵母菌處理液的制備 ①酵母菌懸液：方法同1.4.1。②酵母菌培養原液：取純化后酵母菌接種在30 mL YPD培養基中，28℃、150 r/min振蕩培養。用血球計數板計數并配成1×108 cfu/mL的酵母菌培養原液，備用。③酵母菌高溫處理液：將酵母菌懸液于121℃高壓蒸汽滅菌25 min，備用。④酵母菌上清液：將30 mL酵母菌培養原液6 000 r/min離心7 min，取上清液并用0.22 μm細菌過濾器過濾（徹底除去酵母細胞），備用。

1.5.2 不同酵母菌處理液的抑菌試驗 選取拮抗效果較好的4株酵母菌進行試驗。取0.1 mL酵母菌處理液涂布在PDA平板上，10 min后，在平板的中心接入培養5 d、直徑為4 mm的病原菌菌餅，25℃恒溫培養。每處理重復3次，以涂布無菌水的PDA平板為對照。每天觀察并拍照，4 d后采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑。

1.6 酵母菌對病原菌的重寄生作用和對菌絲生長量的影響試驗

將培養5 d的蘋果輪紋病病原菌菌絲配成菌絲懸浮液。將10 mL菌絲懸浮液和供試酵母菌懸液（最終濃度1×104 cfu/mL）分別加到裝有100 mL PDB培養基的錐形瓶中，25℃、80 r/min恒溫振蕩培養，5 d后于40倍顯微鏡下觀察。培養物用紗布過濾，收集病原菌菌絲，烘干后稱重。

抑菌率（%）=（對照菌絲干重-處理菌絲干重）/對照菌絲干重×100 。

1.7 不同濃度酵母菌對蘋果果實輪紋病的防治效果試驗

方法同1.4.3活體防病試驗。向不同傷口注入30 μL濃度分別為1×104、1×106、1×108 cfu/mL的酵母菌懸液。每處理重復3次，每重復6個果實，無菌水處理作為對照。

1.8 酵母菌生長動態的測定

1.8.1 酵母菌在YPD培養基中生長動態的測定 分別將4株酵母菌加到YPD培養基中，使其最終濃度為1×104 cfu/mL，28℃、160 r/min振蕩培養，1 h后開始取樣，每間隔1 h取樣一次，共取樣30次。試驗重復3次。將所測酵母菌的濃度值轉化成其對數值。

1.8.2 酵母菌在蘋果果實傷口上生長動態的測定 按照Jansiiewicz等[8]的方法測定4株酵母菌在果實傷口的生長動態。取30 μL濃度為1×106 cfu/mL酵母菌懸液于果實傷口中，1 h后測定的酵母菌濃度為起始值（0 h）。將接種的蘋果放入塑料盒中保濕，方法同1.4.3活體防病試驗。測定酵母菌濃度的方法：用打孔器從傷口處取直徑和深度為4 mm的果肉組織放于研缽內研磨，用梯度稀釋平板法記數。每處理重復3次，每重復3個果實。

1.9 酵母菌株的鑒定

1.9.1 形態觀察 觀察酵母菌在培養基中菌落形態，在100倍顯微鏡下觀察酵母菌單細胞形態并拍照。

1.9.2 分子鑒定 用酵母基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取酵母DNA基因組。采用26S rDNA D1/D2區基因序列通用引物擴增[9]。引物NL1： 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，引物NL4： 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。50 μL反應體系：Buffer 5 μL，dNTPS 4 μL，引物NL1（10 μmol/μL）和引物NL4（10 μmol/μL）均為2 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 32 μL。反應程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36個循環；72℃ 7 min[10， 11]。產物在1%（w/v）瓊脂糖凝膠上電泳40 min，置于凝膠成像儀中檢測，目標條帶經切膠回收純化，送至上海博尚生物技術有限公司進行測序。測定的序列提交至GenBank數據庫中與現有的近緣菌株序列比較。用MEGA 6.0軟件以最大似然法構建系統發育進化樹，分析供試菌株與已知酵母菌的親緣關系[12]，確定分類地位。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的分離純化結果

本試驗共分離純化得到30株酵母菌，于-20℃甘油中保存。30株酵母菌均分離于果實和葉片中，土壤中未分離到酵母菌株（表1）。由于果實和葉片中含有豐富的營養和水分，環境條件更利于酵母菌的生長和繁殖，所以更易從中分離。

2.2 離體篩選試驗結果

平板對峙試驗結果顯示，大部分酵母菌對蘋果輪紋病菌具有一定的拮抗作用，拮抗效果比較好的酵母菌株有H22、H3、H4、H5、PY5、S5、T2、T3、T7、Z5、Z8（表2）。將其用于后續的活體防病試驗。

2.3 活體防病試驗結果

根據發病率、病情指數和防治效果，拮抗效果較好的酵母菌株有H3、T2、T3、Z8。其中Z8的防治效果最好，發病率只有27.8%，防治效果為84.1%；T2的防治效果次之，為82.5%（表3）。

2.4 不同酵母菌株處理液對病原菌生長的影響

4株酵母菌的菌懸液和培養原液對病原菌的生長具有顯著的抑制作用，但上清液和高溫處理液對病原菌的生長沒有抑制作用（表4），說明培養原液中對病原菌起抑制作用的是酵母細胞，而不是酵母細胞分泌物。2.5 酵母菌對病原菌的重寄生作用和對菌絲生長量的影響

顯微鏡觀察發現酵母菌株T3有較多的菌體細胞吸附于病原菌的菌絲上，表明其對病原菌菌絲具有重寄生作用，其他3個菌株沒有明顯的重寄生作用，其抑制病原菌的機理有待進一步研究。但4株酵母菌都能抑制蘋果果實輪紋病菌菌絲的生長，與對照相比，病原菌菌絲的生長量明顯降低（圖1，表5）。

2.6 不同濃度酵母菌對蘋果果實輪紋病的防治效果

酵母菌濃度越高對蘋果果實輪紋病的防治效果越好，其中防治效果最好的是菌株Z8，防治效果為59.4%，而濃度為1×104 cfu/mL時，防治效果較差（表6）。

2.7 酵母菌生長動態的測定

2.7.1 酵母菌在YPD培養基中的生長動態 4株酵母菌在YPD培養基中均呈指數型生長，24 h時酵母菌濃度達到峰值，24 h后酵母菌濃度保持穩定（圖2）。

2.7.2 酵母菌在蘋果果實傷口上的生長動態 4株酵母菌均能在蘋果傷口上迅速定殖，48 h后基本達到濃度峰值，在以后的7 d中，酵母菌能穩定定殖在蘋果傷口上，不易受環境影響，耐受力強（圖3）。

2.8 酵母菌株的鑒定

2.8.1 形態學特征 4株酵母菌細胞均呈橢圓形或圓形，橢圓形細胞寬度約為2～3 μm，長度約為4～6 μm，菌落乳白色，光滑濕潤，粘稠，容易被挑起。無性生殖均為出芽生殖，沒有假菌絲（圖4）。

2.8.2 分子鑒定結果 擴增片段大小在500～600 bp（圖5），與文獻資料[13]的數據相吻合。根據特定DNA片段測序結果進行序列比對和系統發育進化樹分析（圖6），結合Kurtzman 等[14]的研究結果及形態特征，將4株酵母菌H3、T2、T3、Z8初步鑒定為季也蒙邁耶氏酵母。

3 討論與結論

目前，防治果實采后病害主要使用化學殺菌劑，雖然化學殺菌劑高效，但易產生安全和質量問題[15]。拮抗酵母菌作為生物防治處理果實采后病害的方法，具有環保、安全的特點，可以替代化學殺菌劑。

蘋果果實輪紋病是由貝倫格葡萄座腔菌引起的一種重要的蘋果采后病害。目前報道的生物防治蘋果輪紋病的方法有很多。例如：Fan等[16]用枯草芽孢桿菌9407產生的芬薺素防治蘋果果實輪紋病具有較好的防病效果，10 d時防病效果達57.5%；Gao等[17]用哈茨木霉T88和深綠木霉T95孢子懸浮液田間防治蘋果輪紋病取得良好效果；Chen等[18]用解淀粉芽孢桿菌PG12防治蘋果果實輪紋病，56 d時的蘋果果實輪紋病發病率為50%，空白對照的發病率為100%，高效液相色譜法分析發現解淀粉芽孢桿菌PG12產生的伊枯草菌素A對蘋果果實輪紋病的防治具有重要作用。酵母菌防治蘋果輪紋病的報道很少，本試驗結果表明，從果實和葉片中分離純化出的酵母菌株H3、T2、T3、Z8在離體篩選與活體防病試驗中都具有明顯的拮抗效果，形態學和分子生物學初步鑒定，4株酵母菌均為季也蒙邁耶氏酵母[過去名稱是季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）]，目前尚未有關于季也蒙邁耶氏（畢赤）酵母防治蘋果果實輪紋病的報道。

果實表面和傷口中營養豐富，水分充足，有利于酵母菌的定殖，30株酵母菌大多分離于果實表面和傷口處，其中具有拮抗作用的4株酵母菌均能迅速定殖于蘋果傷口處，48 h后酵母菌濃度達到峰值，并能穩定存活在蘋果傷口處，與宋聰[19]研究結果一致：酵母菌在培養初期的48 h，前12 h內迅速生長，48 h時達到最高值，此后，數量基本維持在較高水平。酵母菌的接種濃度為1×108 cfu/mL時活體防病效果顯著高于濃度為1×104 cfu/mL，酵母菌濃度越高，活體防病效果越好。

綜上所述，本試驗篩選出的4株季也蒙邁耶氏酵母菌H3、T2、T3、Z8能夠在蘋果果實上穩定定殖，并對蘋果果實輪紋病表現出較好的防病效果，為生防酵母菌在防治果蔬采后病害中的應用提供了依據，但其抑菌防病機理和如何提高防病效果尚需進一步研究。

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