食品中花生過敏原及其檢測方法的研究進展

,,Lisa Wang,,*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)食品科學與工程學院,山東濟南 250353;2.Harmoni International Spice,Inc.,881 S. Azusa Ave,City of Industry 91748,CA)

食品安全在民眾生活中占有不容撼動的位置,與人民的生活息息相關。農獸藥殘留、食品添加劑的濫用、致病菌污染等食品問題對人體健康造成了極大的威脅。在眾多食品問題中,食品過敏問題屢見不鮮。一些特殊體質的人極易對食品中的某些成分發生過敏反應,而這些過敏原很難從食品中去除掉,制約了食品的大范圍流通,且對過敏患者的健康造成了嚴重威脅。目前食品過敏問題是食品行業較為嚴峻的問題。

1995年,聯合國糧食與農業組織(FAO)認定了8種最常見的致敏食物,90%以上的食物過敏反應都是由它們引起的。因此,為了消費者的安全,一些發達國家在食品包裝標簽中強制要求標識過敏原成分[1]。我國針對這一現狀,也出臺了推薦在食品包裝上標識致敏成分的條款。但是,目前在國際上還沒有出臺明確統一的對食品中主要過敏原限量規定的相關文件[2-4]。

花生是較常見的重要食物過敏原之一,會導致嚴重的過敏反應,并且熱穩定性高、能耐酸和耐酶解,一般的生產方式無法去除花生食品的致敏性[5]。目前,正式命名的花生過敏原蛋白有11種,但是有些文獻中也認為有13種,除了已經命名的11種花生蛋白之外,還有一種花生凝集素以及分子量為18 ku左右的油質蛋白[6]。隨著經濟的發展,食品的流通也趨于國際化,花生過敏問題也得到了廣泛關注。本文主要介紹了酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫印跡法、聚合酶鏈式反應(PCR)以及新興的生物傳感器和質譜法等對花生過敏原的檢測。

1 花生過敏原的種類

1.1 Ara h 1

Ara h 1是最主要的花生過敏原,在花生過敏原中含量最多,約占總花生蛋白含量的12%～16%,屬于豌豆球類蛋白,分子量為63.5 ku。花生過敏患者的血清90%以上都能夠識別。在天然狀態下有單聚體和三聚體兩種,以可溶性蛋白的形式存在[7]。對于Ara h 1的三聚體形式,是疏水相互作用將三個單體連接起來形成的同源三聚體糖蛋白,具有很高的穩定性,并且可以耐受胃腸道的消化作用,加熱也不會破壞其過敏性,因此具有很穩定的Ig E結合位點,不容易被破壞,過敏反應非常強[8]。同時,Cabanos等[9]經過研究,確定了Ara h 1三聚體結構的穩定性,并詳細描述了其空間結構。Ara h 1中總共有23個線性Ig E結合位點,與豌豆蛋白相比有40%的相似性。

1.2 Ara h 2

Ara h 2屬于藍豆蛋白,也是主要的花生過敏原,含量約為花生蛋白總量的5.9%～9.3%,同樣能夠引起90%以上的過敏反應。Ara h 2包含Ara h 2.01和Ara h 2.02這兩種遺傳變異體[10],分子量范圍在17～20 ku之間。在72～83號位點上,Ara h 2.02比Ara h 2.01缺失了12個氨基酸[11]。由于Ara h 2中二硫鍵較多,所以結構非常的穩定,并且耐酶解。如果二硫鍵被破壞,其水解敏感性將顯著增加[12-13]。此外,Ara h 2具有抑制胰蛋白酶的特性,并且熱處理能夠提高抑制能力。但是如果二硫鍵被破壞,其抑制劑活性也隨之降低。Ara h 2中共含有10個線性Ig E結合位點,并且易與Ara h 1、Ara h 3引起Ig E交叉反應[14]。

1.3 Ara h 3

Ara h 3的序列與大豆球蛋白有62%～72%的相似,因此屬于大豆球蛋白,結構穩定。有Ara h 3.01 和 Ara h 3.02兩個同種異形蛋白,分子量分別為60、37 ku[15]。44%以上的花生過敏患者的血清能夠識別Ara h 3.01。Ara h 3.01可以水解成一個酸性和堿性的片段,再經過胰蛋白酶消化后,形成一些分子量在13～45 ku的片段,其中的IgE的結合位點可以導致過敏反應[16]。經過研究發現,Ara h 4與Ara h 3的氨基酸序列90%以上具有同源性,屬于同源過敏原,而且線性IgE結合位點有4個相同的[17]。因此,Ara h 4被認為是Ara h 3的一種同種異形蛋白,并命名為Ara h 3.02,但是有些人又將兩者統稱為Ara h 3/4[18]。

1.4 其他

不同于以上3種花生過敏蛋白,其它幾種花生過敏原的研究比較少,還沒有詳細的信息。其中,Ara h 5屬于肌動蛋白,分子量為15 ku,肌動蛋白結合蛋白可以調節細胞內肌蛋白的結構,也可以被肌蛋白所調節;能抑制纖維形肌動蛋白的聚合作用[19-20]。Ara h 6和Ara h 7屬于2S白蛋白,在花生中含量很低,與Ara h 2具有相似性,Ara h 6和Ara h 7與其分別有59%的同源性和35%的相似度,Ara h 6能夠耐高溫和酶解[21-23]。Ara h 6和Ara h 7的分子量都為15 ku,屬于種子貯藏蛋白。Ara h 8屬于病程相關蛋白,分子量17 ku,熱穩定性差,不耐酶解[24]。Ara h 9是一種非特異性的脂轉運蛋白,耐酶解、高溫[25]。Ara h 10和Ara h 11分別屬于16 ku油質蛋白和14 ku油質蛋白,主要來自于花生油脂[26]。Ara h 12的分子量有8、12、5.184 ku三種,Ara h 13同樣有8、11、5.472 ku,屬于防御素。

2 花生過敏原的檢測方法

由于花生過敏患者只能通過不食用含有花生的食物來避免發生過敏反應,所以檢測食品中花生過敏原蛋白含量的方法尤為重要。目前已經有檢測花生過敏原的方法,如免疫學中的印跡法、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)等,以及生物傳感器、質譜法等其他檢測方法。大多數用于檢測過敏原的商業分析工具都依賴于免疫檢測,如ELISA。然而,ELISA和PCR法基于蛋白質和基因水平上進行檢測,雖然檢測速度快,但是極易受到污染而出現假陽性的結果,從而限制了其應用。質譜法等儀器檢測靈敏較高,可以省去繁瑣的提取步驟,并且可以解決提取效率低的問題;還可以滿足直接檢測目標蛋白和變性蛋白的要求;避免了假陽性和假陰性的問題,使用同位素標記的特異性肽段作為內標,可以解決其基質干擾所帶來的一系列問題。

2.1 ELISA

ELISA利用抗原抗體的特異性反應來檢測花生過敏原,具有檢測靈敏度高、特異性強、時間短的特點。ELISA法有夾心法、間接法和競爭法,其中常用雙抗夾心和競爭法,且最低檢測限為0.1～1 mg/kg。

雙抗夾心ELISA既能檢測抗體又能檢測抗原,是一種常用的檢測花生過敏原的方法。陳獻雄等[27]使用雙單克隆夾心法檢測花生過敏原Ara h 1,得到了5 ng/mL的檢測限,并且在5～80 ng/mL的范圍內有良好的線性關系,同時對10種食物中的花生過敏原進行了檢測,結果與標簽標注基本相符,能夠用于快速檢測食品中的花生過敏原。Janssenduijghuijsen等[28]在調查影響花生食用后血清中過敏原檢測的因素時,采用雙單克隆夾心ELISA法檢測花生主要過敏原Ara h 6的存在和數量。檢測結果表明,該方法靈敏度很高,為使用ELISA方法檢測食品中的花生過敏原提供了基礎。目前,可以直接從市面上購買專門的ELISA試劑盒來進行花生過敏原的檢測。最常用的有德國拜發、美國CORTEZ和上海甄準公司的試劑盒。

競爭ELISA是將具有專一性的抗體固著于酶標板上,然后加入待測樣本,使其中的待測抗原與固著于酶標板上的抗體結合,然后加入辣根過氧化物標記的抗原,兩種抗原競爭結合包被抗體,通過顯色可以測定抗原。也可以使用該方法來測定抗體。閆飛[29]等使用ELISA檢測了花生過敏蛋白Ara h 6,IC50為 414.6 ng/mL,在16.5～10000 ng/mL的范圍內,有很好的線性關系,并且精確度和重復性很好。蛋白質經過加熱之后一級結構會發生變化,導致檢測過程中花生過敏原無法被抗體正確識別,出現假陰性。此外,花生過敏原與其他過敏原之間有較強的交叉反應,采用抗原抗體技術也會出現交叉反應,會出現檢測值偏高和假陽性現象。

2.2 PCR法

PCR法是一種基于檢測DNA/RNA的方法。一些花生過敏原雖然耐高溫,但是在實際生產中經常要進行一系列的高溫處理,會破壞過敏原的結構,而經過長時間高溫高壓的處理后在一定時間內DNA仍能保持完整,因此可以使用PCR法來直接檢測花生過敏原基因。目前,在花生過敏原的檢測中最常使用的兩種方法是傳統PCR和實時PCR,并且PCR法特異性強、靈敏度高、簡便快速,對純度要求比較低,DNA粗制品及RNA均可直接作為擴增模板。Dimitra等[30]采集了152份樣品,采用實時PCR方法進行分析。結果表明,花生樣品中有125份(83%)呈陽性,并且在84份未標明花生過敏原的樣品中,48份(57%)呈陽性。因此,實時PCR技術是快速檢測和定量食品過敏原的重要手段。在PCR實驗中需要設計引物,來檢測花生PCR靶基因序列,如果靶序列或引物太短,就容易出現假陽性,需要重新設計引物。并且實驗過程中可能會出現DNA部分降解或完全降解,會導致假陰性的結果。此外,檢測過程中還可能出現交叉污染。另外,Zhang等[31]采用復合引物技術設計了一個競爭性內擴增控制(IAC),建立了花生過敏原Ara h 1 DNA的實時PCR檢測方法。方法的檢出限為0.005%,表明該方法對食品中花生成分的檢測具有較高的靈敏度。

目前由于使用PCR檢測花生過敏原容易出現假陰性和假陽性的現象,對于PCR技術在檢測花生過敏原的推廣還具有一定的局限性。

2.3 印跡法

印跡法(blotting)是將樣品轉移到固相載體上,通過特定的探測反應來檢測樣品。印跡法分為免疫印跡和斑點印跡,一般使用斑點印跡和免疫印跡來檢測花生過敏原,通常將兩者結合起來共同檢測。

免疫印跡(Western blotting)又稱蛋白印跡,是一種分析蛋白質的常用技術,類似于ELISA,都屬于免疫標記技術。利用SDS-PAGE,將蛋白質作為被檢測物,抗體作為“探針”,用標記的二抗“顯色”。首先通過SDS-PAGE電泳將待測蛋白分離,然后膠上的蛋白通過電場力的作用轉移到固相載體,兩者以非共價鍵的形式結合,并且電泳分離的多肽類型及其生物學活性保持不變。該方法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點。Yapo-Crezoit等[32]采用SDS PAGE法和Western blots法兩種方法,對兩份花生種子進行了蛋白質圖譜分析,并結合Western blots對花生種子進行了蛋白質分析。在花生種子的提取物中,發現了致敏蛋白Ara h 1(63.5 ku)、Ara h 2(17,20 ku)和Ara h 3(25、36、40和44 ku)的可見指紋,以及Ara h 3約36 ku的致敏帶,這為花生中主要過敏原的存在提供了證據。Wu等[33]采用免疫印跡鑒定了純化的Ara h 2,其純度可以達到90%,是一種很好的檢測花生過敏原的方法。

膠體金免疫層析法以膠體金為標記物,利用抗原抗體反應進行檢測的新型免疫標記檢測技術。同ELISA一樣,具有3種檢測方式。主要是將膠體金本身的顯色特點與免疫層析技術相結合,進行特異性的檢測。劉悅[34]建立了一種具有高靈敏度的膠體金免疫層析試紙條。能同時檢測3種過敏原。并且檢測結果與試劑盒同步、操作簡單、用時較短并能實現高通量的檢測。為了提高方法的靈敏度,今后可使用單克隆抗體,并且采用上轉換材料、熒光量子點等新型材料作為標記物進行替代。

2.4 生物傳感器法

生物傳感器發展很快,種類眾多,并且逐漸應用到食品的領域中,在花生過敏原蛋白的檢測中最常使用的是免疫傳感器和光傳感器。免疫傳感器是利用抗原與抗體特異性反應而導致檢測裝置信號變化設計而成的一種傳感器,將傳統的免疫測試和生物傳感技術融為一體,具有靈敏度高、選擇性強、檢測限低、檢測速度快的特點。而且分析過程簡單,易于操作,測量過程自動化。Montiel等[35]用磁免疫傳感器成功檢測了食品中的花生過敏原Ara h 2,在87～10000 pg/mL的范圍內有良好的線性關系,檢測限為26 pg/mL,比其它非標蛋白有更好的選擇性。該方法成功檢測了小麥食品中添加的花生過敏原,檢測限低達5 mg/kg,并且能夠成功的應用到不同的提取食物中花生過敏原的檢測。

光敏材料種類繁多,并且有較為廣泛的發展。由于適配體易于修飾和控制,不存在明顯的失活現象,已成為生物傳感器中分析配體的有效分子識別元件。熒光標記適配體可用于分子識別的光學傳感器中。Weng等[36]開發了一個微流控系統,該系統集成了量子點適配體修飾的氧化石墨烯納米生物傳感器,用于簡單、快速、靈敏的檢測食品中的過敏原。該生物傳感器利用量子點-適配體-氧化石墨烯配合物作為探針,在與食物過敏原相互作用時發生構象變化,通過對適配體的吸附和解吸,使氧化石墨烯的熒光猝滅和恢復性能發生熒光變化。在這種現成的微流控芯片中,僅用10 min就實現了對花生中主要過敏原Ara h 1的定量檢測。結果表明,該體系具有顯著的靈敏度和選擇性。將微流控平臺集成到自制微型光學分析儀中,為食品過敏原的快速、經濟、準確的現場檢測提供了一種有前景的方法。并且該生物傳感器選擇相應的適體還可用于檢測其他食物過敏原。

雖然傳感器檢測存在制作復雜、電極用于樣品檢測次數有限等不足。隨著技術水平的不斷提高,各種新型材料應用與傳感器中能夠逐漸彌補這些缺陷,在未來的食品檢測中具有較大的應用前景。

2.5 質譜法

因為缺乏花生過敏原的標準品,所以對于直接使用儀器檢測花生過敏原的文獻并不多。在這種情況下,利用傳統的儀器法建立對花生過敏原定量和定性的檢測方法非常困難。

傳統的應用于分離蛋白質的方法主要有液相色譜法和毛細管電泳法。但是花生蛋白雖然種類頗多,但是理化性質極為相似,使用上述方法進行檢測常會出現基線無法分離的情況,一些極為相似的蛋白質甚至根本無法分離。而蛋白質中的氨基酸具有各種遺傳變異體,它們的保留時間不盡相同,在檢測過程中出現多重峰,導致檢測難度增加。由于蛋白質在紫外檢測器280 nm的波長下都能達到最大吸收,所以經常使用這兩種方法在該波長下進行檢測。但是在280 nm處,基質中的干擾物質也能被吸收。導致這兩種傳統的方法特異性比較差,靈敏度也很差,只有5～15 μg/mL的檢測限。因此,對于食品中微量或痕量的蛋白質的檢測來說該方法并不適用。

為了彌補上述不足,通常采用質譜法進行檢測。質譜檢測器是根據不同蛋白質的質荷比不同將其分離。電噴霧電離后的蛋白質因為流動相pH、儀器等因素不同呈現多電荷分布。質譜法種類頗多,不同的儀器應用方法及特點都不同。目前主要采用LC-MS/MS和ICP-MS來進行花生檢測。

液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)是將復雜樣品經過液相色譜分離后,再用質譜儀進行檢測定性的技術。將兩者的分離功能和定性功能結合起來,對于復雜的混合物也可以很好地進行定性和定量。并且簡化了樣品的前處理過程,能夠快速檢測樣品,操作也比較簡單。Daly[37]等采用質譜法對杏仁和花生的兩種不同的ELISA試劑盒的檢測結果進行了驗證,證明了杏仁陽性檢測結果是由于交叉反應所致。此法成功檢測了花生蛋白,并且能夠彌補ELISA法交叉反應導致假陽性的問題,表明此方法具有很好的發展前景。Shefcheck等[38]從巧克力中直接提取蛋白,經過胰蛋白酶進行消化,再使用LC-MS/MS定性檢測,成功檢測到了花生過敏原Ara h 1,檢測限達到10 mg/kg。

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)在檢測時先由氬氣將樣品引入霧化系統進行霧化,然后樣品以氣溶膠形式進入等離子體中心區,在高溫和氬氣環境中樣品發生去溶劑化、汽化解離和電離,被轉化成正離子后經離子采集系統進入質譜儀,各肽段因為質荷比不同而分離,各元素含量通過元素質譜峰強度來確定。Careri等[39]采用此法與LC-MS/MS法檢測Ara h 2和Ara h 3/4,檢測限分別為5、1 μg/g,并且在10～200 μg/g的范圍內有良好的線性關系。ICP-MS與LC-MS/MS相比,ICP-MS的靈敏度相對較好,但ICP-MS仍有一定的局限性,還有待改進[40]。

現如今,質譜由于具有靈敏度高、分析速度快、樣品用量少、能同時進行分離和鑒定等特點,已經廣泛用于檢測花生過敏原。但是由于對樣品和操作的要求比較高,儀器比較昂貴使得其應用受到限制。

3 結論與展望

本文從蛋白質和DNA的檢測水平綜述了多種檢測花生過敏原的方法。但是這些方法還存在著些許不足,無法達到準確的定量結果。食品加工過程中經常使用的加熱過程,會導致花生過敏原的一級結構被破壞,使得直接檢測花生過敏原蛋白的ELISA法和SPR法出現假陰性。此外可以通過加工工藝將過敏原的DNA片段從食品中完全分離出去,使得直接檢測過敏原DNA的PCR法也無法準確檢測出花生過敏原。同時,對于熱變性蛋白傳統的儀器法也無法檢測,存在一定的局限性。因此,需要建立一種能直接檢測致敏蛋白和變性蛋白的方法,用于食品中的花生過敏原的定量測定。針對以上問題,就目前存在的技術來說,電化學傳感技術和液質聯用是一個比較有發展前景的方法。而現如今,上轉換材料、熒光量子點、碳點等新型材料的廣泛使用也給電化學傳感器、免疫印跡等方法提供了新的研究方向。這些新型材料與目前存在的技術相結合,能夠逐漸彌補目前檢測方法存在的不足,為食品中花生過敏原的檢測提供了廣闊的發展前景。