水產源抗凍蛋白構效關系及在食品加工儲藏中應用的研究進展

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.蕭山出入境檢驗檢疫局,浙江杭州 311208;3.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州 310018;4.中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018;5.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266100)

抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)最早是由Devries于1969年在南極海魚(TrematomasBorchgrevinki)的血液中提取而來[1],是一類有效預防低溫環境下生物體內冰晶生長而損傷細胞,提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物總稱[2]。這類蛋白質與Prism型晶面緊密結合,產生抗凍活性,降低冰晶的冰點,造成冰點與熔點之間出現溫度差,該差值被稱為熱滯活性(thermal hysteresis activity,THA),抗凍活性可用熱滯值表示,熱滯值越大其抗凍活性越強。因而抗凍蛋白又稱為熱滯蛋白(thermal hysteresis protein,THPs)、冰結合蛋白(ice binding proteins,IBPs)或冰結構蛋白(ice structuring proteins,ISPs)[3]。抗凍蛋白由于其特殊的熱滯效應已被廣泛地應用在食品加工儲藏運輸、醫學細胞器官的超低溫保存以及相關農業和工業等領域[4]。目前,國內外關于抗凍蛋白的研究主要集中在魚類、昆蟲、植物、細菌及真菌上[5],尤其近年來植物源抗凍蛋白在食品中的應用逐漸增多,魚源抗凍蛋白的研究雖已較為深入,但其它水產生物源抗凍蛋白的研究甚少。

本文將著重就水產源(魚、蝦、貝及其它水產生物)抗凍蛋白的構效關系及其在食品加工儲藏中的應用進行綜述,旨在對水產源抗凍蛋白結構與功能的關系進行深入探討,為今后研究抗凍蛋白源的更多生物種類、更為有效地利用抗凍蛋白及擴大生產應用提供一定的理論借鑒。

1 水產源抗凍蛋白的構效關系

1.1 魚源抗凍蛋白(Antifreeze protein,AFP)

魚類AFP是迄今為止研究最為廣泛和透徹的一類蛋白,按照氨基酸序列和蛋白質結構的不同,可分為六類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗凍糖蛋白(antifreeze glycoprotein,AFGP)和高活性抗凍蛋白(hyperactive antifreeze protein,HAFP)[2]。紀瑞慶等[6]對魚源六種AFP結構和抗凍活性間的關系做了詳細的綜述。表1總結了六種魚類AFP的相對分子質量、熱滯活性、氨基酸序列、二級結構特征、三維結構圖形、同源蛋白、Protein data bank(PDB)ID、代表性物種。由表1中可以看出,不同抗凍蛋白的熱滯活性不同,且熱滯值越高,其抗凍活性越高。鑒于其獨特的功能,AFP可以提升細胞在冰凍脅迫下抗結冰能力,減緩小冰晶相互結合的速率,修飾冰晶形態,抑制反復凍融造成的重結晶現象,降低過冷卻點,保護細胞膜。使生物體具有抗寒能力和抗凍的作用,避免了低溫對生物造成不可修復的傷害,還可調節原生質體過于寒冷狀態。

表1 魚源抗凍蛋白的結構和特征Table 1 Structure and characteristics of antifreeze proteins from fish species

1.2 蝦、貝源AFP構效關系

迄今為止,蝦、貝源AFP的研究較少,劉志東等[20]及馬慶保等[21]以南極磷蝦(Euphausiasuperba)為原料,以AFP得率為指標,采用特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFP,差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)評價南極磷蝦AFP的熱滯活性。結果表明,南極磷蝦AFP的預測得率為30.12%,分子量約為76 kDa,THA為1.76 ℃。研究發現[13],AFP的冰晶結合位點是相對疏水的,將AFP溶解于水中,其冰晶結合位點可能無法完全展開,活性受到抑制,造成THA的下降。因此,可將AFP溶于低鹽溶液以提高抗凍活性。Carvajal-Rondanelli等[22]從藍貽貝(Mytilus edulis)中提取到AFGP,經研究它是由三肽單元[-Ala-Ala-Thr(雙糖基)-]重復串聯而成的糖蛋白,研究表明,糖基經過乙酰化和過氧化等化學處理后,該AFGP表現為無抗凍活性,因此認為糖基是抗凍活性形成的主要基團。其在溶液中以反平行左手α-螺旋存在,其中疏水基團面向碳骨架,而親水基團面向溶液。研究表明,其抑制冰晶結晶的機理為:溶液中的親水基團和小分子形成氫鍵,阻止了冰核的形成,并且它們的抗凍活性與AFP相對分子量成正相關[4]。

1.3 其它水產生物AFP構效關系

目前,國內外對其它水產生物,如水產無脊椎動物和海藻等水產生物中AFP的研究尚少。Wilkins等[23]首次報道了海洋無脊椎動物海綿(Hamaxinellabalfourensis)的親水提取液在水的晶體形態上表現出非依數性降低冰點的作用。利用反相高壓液相色譜法對提取液進行純化,用基質輔助激光解吸電離質譜法和氨基酸測序鑒定結構分離出主要肽,并對其進行測定,結果表明該物質具有較強的非平衡抗凍活性,相對分子量為2.5 kDa,此類蛋白可能為一種新型的AFP。2009年,Raymond等[24]對南極雪藻擬衣藻進行了研究,一共分析了1300個表達序列標記(expression sequence tag,EST),發現南極雪藻體內存在抗凍活性的功能基因。王興娜[25]研究發現南極冰藻因具有獨特的抗凍基因調節機制,使其可以生存于寒冷、干燥、高鹽、強福射的極地海冰氣候環境。該課題組利用實時定量PCR研究了16種基因在冷凍脅迫條件下的表達變化,并對其中一條抗凍蛋白基因進行了異源表達,深入研究其功能。將AFP基因成功轉化到大腸桿菌并成功表達,發現大部分AFP以包涵體形式存在,并顯著提高了大腸桿菌的抗凍能力。又進一步將AFP轉入萊茵衣藻中,發現部分重組藻株的抗凍活性略有增強。Raymond等[26]還在南極綠藻、雪藻、衣藻、苔蘚和藍藻中提取出具有抑制冰重結晶半純品的冰活性物質,對該物質進行加熱處理,其抑制冰晶重結晶的能力降低。因此,推測該物質可能為某種AFP,通過與冰特定結合而抑制冰重結晶。其中衣藻AFP能特異性地同時結合到冰晶的棱面和基面,使冰晶沿a軸生長,結果使冰晶呈盤狀,其抗凍活性更高,被稱為高活性抗凍蛋白[4]。由此表明,不同來源的AFP結構有明顯區別,但是其抗凍機制主要是通過與冰特定的結合作用而實現的。

2 AFP在食品加工儲藏中的應用

2.1 AFP在水產品中的應用

2.1.1 AFP在轉基因水產品加工中的應用 由于天然提取的AFP含量較低,利用轉基因技術人工合成AFP已在很多領域實行。Fletcher等[27]首次將美洲擬鰈(Pseudopleuronectesamericanus)血淋巴AFPⅠ直接注入虹鱒魚(Salmogairdneri)體內,結果顯示虹鱒魚產生抗凍活性,且AFP沒有受體種屬特異性。之后我國研究人員利用AFP轉基因技術提高水產生物的耐低溫性,并對此做了許多研究。如,李衛東等[28]構建了美洲大綿鳚(Macrozoarcesamericanus)中的一種AFP Ⅲ(HPLC-12)表達基因載體,并借此載體通過轉基因的方法快速培育南方重要經濟貝類—雜色鮑耐低溫新品種,研究結果表明HPLC-12抑制冰晶重結晶活性最高,此亞型在酵母細胞中表達后,產生亞基單體蛋白,這種單體蛋白相對于其他的二聚體或多聚體AFP具有明顯的優越性,不需要蛋白酶或其它化學物質的催化即可直接產生抗凍活性。楊敏等[29]將從南極魚綿鳚科中提取的多聚AFP Ⅲ基因克隆得到AFP Ⅲ的四聚體,并構建真核表達質粒,篩選獲得穩定表達的細胞系,將其轉到斑馬魚細胞系中,發現AFP Ⅲ的四聚體基因可以在斑馬魚細胞系中大量表達,并且能夠能顯著增強細胞的抗寒能力,減少斑馬魚細胞在低溫脅迫下的死亡率。利用AFP進行水產生物轉基因技術成功的案列還有:將抗凍蛋白通過基因工程技術應用在不耐寒的水產經濟動物羅非魚體內,使其具有抗寒性,不僅延長了羅非魚的生長期,還擴大了養殖范圍,提高了產量[4]。由于低溫對水產生物的影響限制了養殖業的發展,然而抗凍蛋白的發現和生物技術的發展為水產養殖業提供了廣闊的發展前景。另外,轉AFP基因的水產品還有遮目魚、鮭魚、鯪魚、金魚及羅氏沼蝦等。這些耐低溫的水產新品種不僅對促進水生經濟動物轉基因育種工作的開展具有重要意義,而且可以改變當前的養殖范圍,降低生產成本,提高經濟效益[5]。因此,將AFP應用在轉基因水產品加工領域具有重要的意義。

2.1.2 AFP在水產品凍結或凍藏中的應用 低溫冷鏈物流是水產品生產、運輸過程中不可或缺的環節,在此期間,水產品會經歷解凍、凍結、解凍等循環反復凍融過程,其內部水分子會經歷冰晶形成和重結晶等現象,導致細胞汁液流失,體液局部濃縮,細胞組分變化和蛋白質變性。這些現象會嚴重降低水產品品質[30]。在水產品冷凍加工和儲藏時,冷凍的溫度及速度會引起冷凍產品的組成成分及產品質量發生變化。如冷凍魚糜冷凍過程中,食品內部水分子會產生冰晶,若冷凍速度過慢,造成冰晶過大,蛋白質變性,食品營養價值降低[4]。但是,在凍結或凍藏水產品中添加AFP,可以有效降低解凍水產品的汁液流失率,蛋白質氧化、變性及聚集程度,提高冷凍制品的品質。

譚昭儀等[31]研究了在24周的凍藏周期內,添加新型AFP對鳙魚魚糜凝膠強度及蛋白質冷凍變性的影響。結果表明,在魚糜凍藏前添加AFP,可以抑制鹽溶性蛋白在凍藏過程中的變性,保持魚糜良好的凝膠特性。Ohta等[32]研究發現,向凍藏的魚肉中添加脯氨酸可以抑制Ca2+-ATPase活性的降低,提高冷凍魚肉的保水性。這可能是因為脯氨酸使得包埋在蛋白質結構中的AFP基團被釋放出來,提高冷凍品的耐儲藏能力,防止其冷凍變性,改善產品品質。宋麗麗等[33]研究了12% NaCl和0.2 mol/L AFP混合抗凍液浸漬，對不同凍藏溫度下的斑點叉尾鮰魚片解凍后品質和蛋白質變性的影響。結果表明,由于AFP具有非依數性的降低冰點,抑制冰晶生長速度的特性,添加AFP可以降低解凍鮰魚片的pH,減少解凍后水分流失,維持較低的K值和揮發性鹽基氮含量,緩解脂肪氧化,保持較高的鹽溶蛋白含量和Ca2+-ATP酶活性。因此,AFP可有效保持解凍鮰魚片較好的品質,減輕解凍鮰魚片蛋白質冷凍變性的程度。另外,還可以將AFP通過直接混合、浸泡、真空滲透或制備抗凍液等方法，應用于水產品的冷凍及解凍加工過程中,使內部水分子形成均勻的小冰晶,抑制重結晶,減少細胞損傷以及防止蛋白質變性而引起的肉質持水能力下降,改善水產品在解凍過程中常出現的汁液流汁、軟爛等問題,提高水產品質量[4]。

2.2 AFP在肉制品中的應用

豐富多樣的加工肉制品越來越受到廣大消費者青睞。但加工肉制品的理化性質、營養成分和食用安全性易受各種加工及貯藏環境因素的作用而產生變化,如蛋白質變性和脂質氧化等。將AFP應用到肉制品儲藏加工中,可有效提高產品品質。Yeh等[34]從乳酸鏈球菌中生產并重組了一種新型AFP,并將之添加在冷凍豬肉中,對解凍后體積、形狀、顏色、質地、氣味和接受度進行評估,結果表明添加AFP的豬肉汁液流失少,色澤質地較好,感官評價分數較高。微觀結構中可以看出添加AFP的冷凍豬肉,細胞內冰晶較小,組織結構較完整。對冷凍豬肉的品質研究表明,AFP可以防止蛋白含量降低,減少營養流失,提高冷凍肉制品品質。Payne等[35]在羔羊宰殺之前,將南極鱈魚AFGP注射入其體內,宰后-20 ℃冷凍儲藏,掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察解凍羊肉微觀結構,結果發現,在屠宰前1 h或24 h注射AFPG,都可有效減小冰晶體積,抑制重結晶現象,且減小程度與冷凍前浸泡AFGP的濃度和浸泡時間有關。實驗證明在宰前24 h注射AFPG,且注射濃度為0.01 mg/kg時可有效減少滲水情況,羊羔肌肉中所形成的冰晶達到最小,保持了肉制品原有結構,營養成分流失最少。Boonsupthip[36]的研究則表明在冷凍和冷藏期間,III型AFP明顯保留了羅非魚肌動球蛋白Ca2+-ATP酶活性,有效阻止冷凍羅非魚肉中肌肉蛋白形成凝膠狀,抑制了冷凍肉的重結晶現象。結果顯示,AFP III對冷凍羅非魚肉的保護作用更是優于傳統的低溫保護劑(蔗糖-山梨糖醇混合物)。另外,解凍時,把畜禽肉浸泡在AFP溶液中也可明顯減少冰晶的生成,抑制重結晶帶來的汁液流失,水分遷移,蛋白質氧化和細胞損傷,從而保持產品品質和風味[30]。

2.3 AFP在冷凍面團中的應用

面團在冷凍狀態下便于保藏和運輸,得以迅速發展。然而,冷凍面團在凍藏過程中,表面失水使得內部水分緩慢移動到表面,造成面團中水分的喪失,使其表面產生皺縮、裂紋等現象,影響冷凍面團品質及外觀[37]。另外,溫度波動造成冷凍面團中冰晶產生重結晶,破壞面筋蛋白網絡結構,降低冷凍面團品質,使其醒發時間延長、比容減少[38]。研究表明,可以通過添加冷凍保護劑來改善面團品質。AFP作為一類新型的食品添加劑,可以有效降低冷凍面團在冷藏過程中產生的負面影響,目前發現的此類AFP源有水產生物、大麥籽粒、冬麥草、燕麥、歐白英以及胡蘿卜等[39]。

將水產源AFP應用于冷凍面團中,可顯著改善產品的口感和營養價值。姬成宇等[40]研究了凍藏和凍融循環下魚源AFP對冷凍面團的蛋白質特性以及水分子存在狀態的影響,結果表明,AFP能夠抑制二硫鍵的斷裂和二級結構的變化，且降低凍融循環過程中面團水分的流動性,減少水分的遷移,有效的提高了面團的持水能力。另外,AFP的冰晶形態修飾作用和抑制重結晶效應均會減小酵母和面筋結構受破壞的程度,提高恒溫凍藏下預發酵冷凍面團的比容,抑制酵母凍藏和凍融過程中產氣力,提高面團的持氣能力[40]。Panadero等[41]提取了極地杜父魚(Myoxocephalus aenaeus)的AFP,并在工業釀酒酵母菌株中合成并重組成一種Ⅰ型AFP GS-5,在面包酵母中,GS-5的外源表達增加了冷凍耐受性,并在冷凍面團中增強了產氣能力,減弱了凍融循環過程對冷凍面團面筋結構的弱化作用，并有效保護冷凍面團超微結構,總之,冷凍面團中魚源AFP的表達可有效增加酵母細胞的活力,提高冷凍面團的品質。李靈等[42]通過將鯊魚源AFP添加到馬鈴薯面團中,研究在凍融循環條件下AFP對冷凍馬鈴薯面團品質的保護作用。結果表明,添加1% AFP可使馬鈴薯面團比容增大、發酵時間縮短、淀粉糊化度減弱、失水率降低,馬鈴薯饅頭的硬度、咀嚼性和膠粘性都顯著低于對照組,核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析顯示AFP可以影響冷凍馬鈴薯面團中的水分狀態,使深層結合水含量增加,半結合水含量減少,還能抑制水分流失,提高馬鈴薯面團的持水力。因此,AFP可作為冷凍馬鈴薯面團產品的低溫保護劑。另外,將AFP應用在速凍面食,如湯圓、水餃中,可有效減少其營養物質的損失,提高速凍食品品質。單從硬度值上對AFP的應用價值考量,2.5%的AFP添加量是速凍湯圓的最佳添加量,與空白實驗相比,添加AFP的湯圓呈現較光滑的外觀且濁度降低,渾湯清晰透明,易被人們所接受[3]。

2.4 AFP在果蔬中的應用

2.4.1 AFP在轉基因果蔬加工中的應用 果蔬在栽培、種植以及收獲后低溫保鮮儲藏和速凍加工過程中都會遭受冷害。但是,傳統的育種方法抗寒效果不佳,而轉抗凍基因的果蔬品種則表現出良好的耐寒性,還可擴大種植范圍,延長貨架期。因此,近年來關于轉AFP基因的果蔬品種逐漸增多。美國DNAP公司將水產源AFP通過基因工程使其在番茄中表達,培育出耐寒番茄新品種。研究發現AFP不僅降低了細胞內水分的凝固,還增加了細胞的存活率,該轉基因番茄能在-6 ℃生存幾個小時,并且其果實冷藏后不變形[5]。將冬季比目魚AFP基因通過真空透析導入馬鈴薯、擬南芥和油菜中后,發現該轉AFP基因生物的冰點降低了1.8 ℃,也證實了通過轉基因技術,培育耐寒性植物的可行性[5]。利用轉基因技術和分子生物學,使抗凍基因在目標果蔬中表達,其中成功案例還包括轉AFP基因甜菜、柑橘、草莓、甘蔗、甜椒、葡萄等,這些轉AFP基因的果蔬經研究表明具有耐寒性和耐儲藏性[30]。

2.4.2 AFP在果蔬儲藏中的應用 一般來說,果蔬貯藏時的溫度越低,品質保持的越好,貯藏溫度若能降低1 ℃,就可以明顯延長某些果蔬的貯藏壽命[43]。新鮮果蔬貯藏時均需有適宜的最低溫度,其貯藏的低溫臨界溫度因品種不同而異,低于此溫度會造成果蔬的冷害和凍害。速凍果蔬在凍藏解凍過程中常出現汁液流失、軟爛、失去原有形態等問題,因此,AFP在果蔬的冬季貯存和保鮮中有重要的應用價值。Ruims等[44]研究了Ⅰ型AFP通過真空浸漬(58 KPa,5 min)于豆瓣菜中,通過色差、掃描電鏡和萎蔫試驗來評價AFP對豆瓣菜形態品質的影響。結果表明,經過真空浸漬AFP的樣品,細胞壁更清晰,細胞形狀更圓潤,添加AFPⅠ的葉子具有更高的透氣性,另外,AFP還可以降低豆瓣菜在冷凍過程中的冰晶尺寸、抑制再結晶現象,有效提高了凍藏蔬菜的品質。因此AFP可作為在冷凍食品,尤其綠葉蔬菜中重要的食品添加劑。Kong等[45-46]就AFP預處理對胡蘿卜和櫻桃質構、汁液流失、冰晶形態大小以及揮發性化合物的影響做了綜合評價。結果表明,在冷凍過程中,AFP對果蔬冰晶形態進行了修飾。AFP預處理降低了凍藏和解凍過程對胡蘿卜和櫻桃造成的汁液流失以及對顏色和質構等物理特性的影響,抑制總花青素、揮發性物質、酚醛和抗氧化等成分的損失,提高了冷凍果蔬的品質,證實了其在體外的抗凍活性,從而證明了AFP在冷凍食品中的應用潛力。因此,AFP可在果蔬儲藏及運輸過程中減少汁液流失和營養成分的損失、減少細胞損傷以及保持食品質地。

2.5 AFP在乳制品中的應用

冰淇淋的加工和儲藏過程中,冰晶感會嚴重破壞冰淇淋的質地和口感,因此控制冰淇淋中冰晶的尺寸、形狀及分布可以有效改善冰淇淋的組織細膩程度,冰晶越小、分布越均勻,其口感越柔軟細膩[47]。但是冰淇淋在凝凍、硬化、貯藏和運輸過程難免遇到溫度波動,不斷的解凍和凍結現象會造成冰晶增大和重結晶現象,導致冰淇淋質地粗糙,口感不佳。美國DNAP公司將AFP添加于冰淇淋和冰奶中,消除了冰渣,改善了產品的質量和口感[30],因此可以證明AFP是潛在的冷凍乳制品添加劑。在冰淇淋的加工過程中,將傳統的硬化步驟用1～100 mg/L的AFP添加到冷凍混合物中來替代時,結果發現可有效降低冰晶的重結晶率,改善成品的口感細膩度[48]。在探究AFP對冰淇淋口感的影響時,把少量的AFP加入到已融化的冰淇淋樣品中,于-80 ℃下迅速冷凍,在-6～-8 ℃下放置1 h后,可觀察到,與對照相比,添加AFP的樣品中冰晶明顯變小[30]。研究表明,將AFP添加到冷凍乳品如冰奶、冷凍酸奶、軟香乳凍、冰凍果子露以及冷凍甜食如冰糕、冰沙、冷凍果漿中,能夠形成一種牢固的、密集的連續網絡結構,有效抑制了冷凍乳制品在儲存過程中冰晶的形成和重結晶等現象,使其品質得到顯著的改善[30]。將AFP應用在乳制品中,可有效降低冰渣對產品的影響,提高產品的細膩潤滑度,使其口感更佳,質量更好。

3 結論與展望

抗凍蛋白因具有熱滯活性、修飾冰晶形態、抑制冰晶重結晶、降低過冷卻點和保護細胞膜等作用而具有廣闊的應用前景[3]。目前,對抗凍蛋白的作用機理及應用雖已有較為深入、廣闊的研究,但由于其提取率低、性質不穩定,而人工合成又存在成本高、安全性等問題使其在規模化生產應用方面受到很大限制[30]。未來應通過基因工程和分子生物學等方法手段共同致力于抗凍蛋白的應用研究,實現低成本、高質量、大規模的抗凍蛋白開發,將抗凍蛋白應用在食品加工和儲藏中,以期減少細胞損傷和營養流失,保持產品品質和風味,提高食用安全性等。因此,隨著科學的進步,抗凍蛋白將在食品工業、生物材料的保存、醫藥領域、抗寒性相關轉基因工程甚至更廣闊的領域有更為廣泛的應用。