食源性免疫活性肽的研究進展

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(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730124)

食源性免疫活性肽無毒、低敏、安全性高且可以調節人和動物機體免疫能力,免疫活性肽在人類營養健康和疾病調節中發揮著不可替代的作用,它已逐步加入到新的功能性食品及臨床治療中。人們對免疫活性肽的研究始于1918年,Jolles等[1]采用胰蛋白酶對乳蛋白進行水解得到免疫活性肽,并證明其具有提高巨噬細胞吞噬外來異物的能力，之后國內外的研究者發掘不同食物源蛋白質,酶解得到免疫活性肽，并對其結構及臨床應用進行深入研究。我國學者王廣先等[2]將免疫活性肽應用到臨床應用中,用于治療肺癌,并取得顯著效果。目前,國內外已將免疫活性肽應用到工業生產中，制備肽類藥品及功能性食品。

食源性免疫活性肽的食源性蛋白質大多取自食品加工副產物,這不僅使加工副產物得到綜合利用,創造更大的經濟效益,還可降低了環境污染,其社會效益與經濟效益并重。因此,本文對食源性免疫活性肽的新技術體系與研究方法進行分析總結,這對掌握食源性免疫活性肽的研究現狀、優勢和不足,以及規劃未來的研究方向具有指導意義。

1 食源性免疫活性肽分類

食源性免疫活性肽種類眾多,按來源可分為植物源、動物源及微生物源免疫活性肽。

1.1 植物源免疫活性肽

1.1.1 大米免疫活性肽 大米是我國主要的口糧,但大米附加值低,增值有限。以稻谷加工的副產物米糠為例,日本米糠的綜合利用率達到100%,同為發展中國家的印度也達到了30%,而我國米糠的綜合利用率尚不足20%,資源浪費嚴重[3]。所以有效利用加工副產物可以避免浪費資源,提高附加值。Takahashi等[4]從大米胰蛋白酶水解物中分離出一個九肽,其氨基酸序列為Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg(oryzatensin),并證明其具有增強巨噬細胞吞噬能力、促進腸道收縮和抗嗎啡等免疫調節作用。卜漢萍[5]采用堿性蛋白酶制備大米免疫活性肽,用201x7型強陰離子交換樹脂對大米免疫活性肽進行分離純化,提高了大米免疫活性肽對巨噬細胞的增殖活性。王璐等[6]通過胰蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解分離純化出的大米肽，能促進巨噬細胞RAW264.7的增殖,其中,分子量180～1000 Da的酶解肽具有最佳的促增殖效果。Xu等[7]研究發現富硒大米蛋白酶解物可以增強RAW 264.7巨噬細胞吞噬能力,保護鉛引起的免疫細胞毒性,證明大米活性肽對免疫細胞具有免疫保護作用。

1.1.2 大豆免疫活性肽 1970年,美國就研制出大豆多肽產品,并建成了年產5000 t食用蛋白肽的工廠,日本于20世紀80年代開展此方面的研究并成功地將其應用于食品工業。我國于20世紀80年代后期也相繼開展了對大豆多肽的研究。楊小軍等[8]研究發現,大豆蛋白酶解物有明顯的刺激淋巴細胞轉化作用,能顯著促進大鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力、刺激胃腸道黏膜，提高腸腔分泌免疫球蛋白(sIgA)。余承高等[9]研究發現高活性大豆肽可對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞、自然殺傷細胞(NK cell)活性有顯著增強作用,證明大豆肽對機體具有免疫增強作用。左倩等[10]通過對仔豬灌胃的實驗，證實了大豆肽能提高腸黏膜免疫功能,上調免疫相關基因表達量,從而提高IgG和sIgA含量,增強仔豬免疫功能,更好促進仔豬的健康。

1.1.3 小麥源免疫活性肽 1979年,有研究人員發現小麥谷蛋白的胃蛋白酶水解液中具有阿片活性的肽類物質,命名為面筋外啡肽,目前,對小麥免疫活性肽研究較多的仍然是阿片肽。張亞飛等[11]通過體外淋巴細胞增殖法，檢驗小麥蛋白堿性蛋白酶水解物對免疫細胞的增殖作用,證明了小麥免疫活性肽的存在。代卉等[12]采用堿性蛋白酶水解小麥蛋白，得到具有調節機體免疫功能的肽,研究發現其具有抗氧化活性,還可以增強脾細胞增殖能力和巨噬細胞的吞噬能力。此后,該課題組進一步采用小麥肽對受環磷酰胺免疫抑制小鼠進行灌胃,證明了小麥肽不僅可以恢復HC50和脾細胞增殖,顯著提高抗體生成細胞含量和腹腔巨噬細胞吞噬能力,還可以增強小鼠血清清除DPPH·和清除·OH的能力[13]。

1.1.4 植物藻類免疫活性肽 海藻和微藻是具有光合作用的海洋生物,藻類食物本身就具有免疫調節功能,藻類水解物更是免疫活性肽的重要來源之一。Morris等[14]將經胰蛋白酶水解后的小球藻飼喂給營養不良的BALB/c小鼠,發現其先天性免疫和特異性免疫應答均增強,包括巨噬細胞吞噬能力、細胞介導免疫、依賴T淋巴細胞的抗體反應等。Cian等[15]從一種紅色海藻中酶解得到促腎上腺皮質激素釋放激素(PCRH),試驗證明其可促進大鼠的脾淋巴細胞增殖，降低細胞抑制因子的產生,從而起到免疫調節作用。由于技術以及藻類本身具有免疫調節作用,目前我國對藻類免疫活性肽的研究較少,有待進一步發掘研究。

1.1.5 其他植物來源的免疫活性肽 植物源免疫活性肽種類眾多,除了上述大米、大豆及小麥等食源性免疫活性肽,還有玉米、水果及蔬菜等同樣成為免疫活性肽的重要來源。玉米源免疫活性肽研究比較多,馬子淇等[16]用單因素及正交法證明胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解物，對小鼠T淋巴細胞增殖具有顯著的促進作用,隨后又研究了玉米黃粉免疫活性肽的最佳制備工藝,得出經胰蛋白酶水解提取,酶濃度3.0 g/L,底物濃度60 g/L,溫度45 ℃,pH8.0,水解90 min[17],并進一步證明大孔樹脂脫鹽純化后的玉米黃粉免疫活性肽，具有促進小鼠脾淋巴細胞增殖的能力且有劑量依賴性。通過雙層包埋法將其進行包埋制成微膠囊,提高其穩定性,便于日后人們使用及工業化生產。2012年,許金光等[18]用胰蛋白酶酶解軟棗獼猴桃制備多肽并對其進行免疫試驗,證明軟棗獼猴桃多肽對小鼠機體免疫系統的免疫功能有增強作用。2018年,王鵬等[19]酶解榛仁蛋白得到分子質量小于3kDa的組分,并采用凝膠色譜及反相高效液相色譜對其進行分離純化,得到了榛仁免疫活性肽序列:Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg(pedefr),并證明其對細胞無毒性作用,且當濃度達到100.0 μmol/L時,可促進脾淋巴細胞增殖率達到44.21%,在伴刀豆蛋白A共同作用下,增殖率達到53.22%。除上述植物源活性肽外,還有學者從蕎麥[20]、花生[21]等蛋白質中制備出免疫活性肽。

1.2 動物源免疫活性肽

1.2.1 乳蛋白免疫活性肽 Mercier等[22]研究乳清蛋白及其酶解產物,證明乳清蛋白中含有免疫調節肽,表明構成免疫活性肽的氨基酸種類、數量和序列對其免疫活性有重要影響,強疏水作用能促使免疫活性肽與細胞膜相互作用從而增強其免疫活性。乳蛋白免疫活性肽,可以調節動物及人體免疫能力。早在1991年，乳蛋白免疫活性肽就已應用到臨床試驗,并取得顯著效果。Hadden等[23]用注射法將Tyr-Gly和Tyr-Gly-Gly兩種乳蛋白免疫活性肽給93位艾滋病病人用,發現這兩種肽能提高艾滋病人免疫能力,減緩艾滋病病情惡化,證明免疫活性肽對人體免疫功能具有增強作用。Miyauchi等[24]報導了牛乳鐵蛋白基因(LF)的胰蛋白酶水解物也具有免疫調節作用。徐鑫等[25]用響應面法優化了胰蛋白酶酶解酪蛋白酸鈉制備免疫肽的酶解條件,獲得了酶解制備免疫活性肽的最優工藝。張奕等[26]從發酵駝乳中提取出免疫活性肽,并證明其可降低BALB/c小鼠脾淋巴細胞中核因子-кB和白細胞介素6的表達,同時明顯升高γ-干擾素、白細胞介素12和白細胞介素23的表達,以此對細胞產生免疫調節作用。乳中蛋白含量豐富,乳蛋白是最富營養價值的蛋白質之一,也是含免疫活性肽最豐富的蛋白質。乳蛋白酶解是目前獲得食源性免疫活性肽的主要來源,目前對其研究多在體外進行,應用于臨床及在體內發揮功效的研究相對較少,有待深入探究。

1.2.2 鹿茸免疫活性肽 2010版中國藥典載,鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。姜紅等[27]確定了木瓜蛋白酶水解鹿茸血制備免疫活性肽的最佳酶解條件,酶解得到兩條肽,通過體外活性試驗，證明其中一條酶解產物能顯著刺激脾淋巴細胞增殖,對·OH和DPPH·有較高的清除作用。張夢瑩[28]持續給予小鼠鹿茸乙醇提取物,發現能夠一定程度上增強小鼠免疫力,證明了鹿茸乙醇提取物有良好的免疫調節作用。趙磊等[29]通過酶解得到鹿茸蛋白肽,確定了肽的最佳酶解條件,發現了堿性蛋白酶酶解物VAWP-SGD在無誘導劑時,對小鼠脾細胞增殖有顯著促進作用,其對ConA誘導的小鼠脾T細胞增殖促進作用最顯著。

1.3 微生物源免疫活性肽

梁奉軍[38]對8個小肽進行拼接，設計出具有免疫刺激活性的雜合肽,并分別在其C-末端和N-末端添加起始密碼子ATG和釀酒酵母強終止密碼子TAA,導入釀酒酵母,通過對照試驗證明免疫增強型酵母可顯著提高育苗的成活率,對白化病有很好的免疫增強作用。Morris等[39]采用胰酶水解小球藻制備免疫活性肽,將其飼喂給BALB/c小鼠,發現小球藻免疫活性肽具有促進BALB/c小鼠骨髓細胞增殖、提高巨噬細胞吞噬能力等作用。食用免疫活性肽后的BALB/c小鼠先天性免疫和特異性免疫應答均增強。Cian等[40]酶解一種紅色海藻(柱葉帚霉),酶解得到富含Asp、Ala和Glu的高水解蛋白酶解物,將其飼喂給大鼠,證明其可促進大鼠的脾淋巴細胞增殖,具有較好的免疫活性。

2 食源性免疫活性肽制備方法

2.1 微生物發酵法制備免疫活性肽

微生物發酵是利用微生物自身的胞外蛋白酶降解食源蛋白質的過程,微生物發酵工藝根據底物的不同分為液態發酵和固態發酵兩種。李善仁等[41]分別采用固態、液態發酵法利用混合菌種制備大豆肽,證明液態發酵時菌株發酵產酶水解更充分,更有利于降解豆粕蛋白。其使用發酵法制備活性肽的目的及優勢在于，可以利用微生物降低或消除食品中存在的苦味。劉旺旺等[42]以不同菌種液態發酵羊胎盤殘留物制備活性肽進行研究比較,證明分子量大小對產物的生物活性有一定的影響,并對各組分進行免疫細胞增殖活性的研究,相同胎盤肽質量濃度(100 μg/mL)下,黑曲霉的免疫細胞增殖活性最高。

微生物發酵法使用時間較早且范圍較廣,發酵產物均勻且風味較好,微生物種類、數量及生產條件對發酵效果有至關重要的作用。但發酵工藝生產周期長,暫無統一固定工序流程,因此產品質量不穩定[43]。

2.2 酶水解法制備免疫活性肽

酶水解法制備免疫活性肽,是目前制備生物活性肽的主流方法,其操作條件溫和、易控,需要控制合適的酶和確定所需的時間、底物濃度、溫度、pH等條件,方便快捷、安全性高。酶解技術可控制酶切位點,控制制備肽的分子質量[44]。常用的蛋白水解酶有三類:動物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶等;植物蛋白酶如木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶等;微生物蛋白酶如細菌膠原酶等。張銳昌等[45]酶解小麥蛋白制備肽,采用響應面法優化胃蛋白酶酶解工藝條件,得出最佳條件為是溫度為41 ℃、pH為2.0,底物濃度為3%,加酶量為1500 U/g,酶解時間為7 h。堿性蛋白酶的最佳酶解工藝是溫度為70 ℃,pH為8.0,底物濃度為3%,加酶量為1200 U/g,酶解時間為120 min。酶法制備肽適合生產小肽,其成本低,但蛋白酶的水解作用可能會產生許多副產物,而且缺乏合適的蛋白酶,產率較低。但是綜合考慮成本、技術的成熟度等因素,酶法水解蛋白質生產活性肽具有較高的可行性。鄧志程等[46]通過模擬胃腸消化的方式對馬氏珠母貝全臟器進行酶解,并利用人工神經網絡對胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶酶解階段的工藝過程進行模擬優化,水解馬氏珠母貝并分離純化的兩條二肽Ala-Arg、Val-Arg。它們顯著提高小鼠淋巴細胞的轉化能力和體液免疫的水平,并極顯著地增強經抗原誘導的小鼠免疫應答能力。

3 展望

很多食物源蛋白質是制備免疫活性肽的良好原料,食品加工生產的副產品和廢料中蛋白質含量豐富,這樣既節約了資源又保護了環境。目前,酶水解法制備免疫活性肽為最具有發展前景的免疫活性肽制備技術,一些問題已隨著科學技術的發展得到解決和改善,例如利用復合酶解決單一酶酶解不完全的問題,但依然存在一定尚未能解決的問題,例如如何對蛋白肽鍵進行靶向性地酶解，仍是蛋白質酶解制備活性肽最難解決的核心技術。相對于酶解法而言,微生物發酵的過程中能夠產生多種蛋白酶,微生物蛋白酶具有活性高、成本低的特點。植物原料發酵副產物可用作飼料,可有效避免浪費。所以此方法有待進一步深入研究。使用微生物發酵法,可用廉價的原料大量生產免疫活性肽,這將對畜牧業、糧食加工產業以及其他相關產業的發展產生深遠的影響。此外,隨著研究方法及科學技術的不斷提高,未來將會有越來越多的動、植物及微生物源免疫活性肽被發掘并得到深入研究。此外,延長食源性免疫活性肽的保存時間、提高其穩定性以及利用現代生物技術預測以及制備、合成新的免疫活性肽也是極有價值的發展方向,而對免疫活性肽作用機理的探究及其安全性評價的摸索，更是今后需要深入研究的課題之一,只有在了解其調節機理和進行全面的安全評價后,免疫活性肽產品才能更好的用于實踐,今后的研究空間將更加廣闊。