交聯酶聚集體性能改善研究進展

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(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025;2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室,貴州貴陽 550025;3.貴州大學化學與化工學院,貴州貴陽 550025)

酶是一種可再生能源,在溫和條件下,以高區域選擇性和立體選擇性發生酶促反應,被廣泛應用于食品、制藥、化工等領域[1-2]。但在某些惡劣條件下,酶易變性和失活,這限制了它們的應用。因此,長期以來,人們都在不斷努力開發有效的固定技術以增加酶的穩定性,并促進它們的回收和再循環。20世紀60年代,Doscher等[3]首次通過戊二醛與蛋白質表面上的反應性NH2基團反應產生了蛋白質交聯技術。隨后,該技術被用于結晶酶的交聯以生產交聯酶晶體(CLEC)[4]。但CLEC需要高純度酶并使酶結晶,該過程費時費力。因此,Cao等[5]在此基礎上通過沉淀酶代替結晶過程,并交聯所得到的物理聚集體。從此,一種新型固定化酶技術產生-CLEAs技術。

CLEAs技術操作十分簡單,僅需要經過沉淀和交聯兩步。在沉淀過程中,酶分子通過非共價鍵結合在一起發生沉降,該過程不會擾亂它們的三級結構。而交聯主要是雙功能交聯劑通過在相鄰酶分子表面上與賴氨酸殘基的游離氨基發生反應,形成由分子間和分子內羥醛縮合產生的低聚物或聚合物,該過程涉及席夫堿形成和邁克爾型1,4加成到α,β-不飽和醛部分(圖1)。因此,通過該技術制得的CLEAs能夠很好地保留酶原始催化活性,并提高儲存穩定性和操作穩定性[6-7]。被廣泛應用于水解酶、氧化還原酶以及裂合酶等多種酶CLEAs制備中。同時,該技術還可用于制備催化多種生物轉化的multi-CLEAs,這不僅避免了不穩定中間體的積累,還能減少二次不良反應[8-9]。

圖1 交聯酶聚集體(CLEAs)制備方法Fig.1 Cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)preparation strategy

目前,CLEAs技術不斷被用于不同種類和不同來源的酶固定化當中,而粒徑、活力以及穩定性是評價CLEAs性能的重要指標。因此本文從粒徑、改善CLEAs活力和提高穩定性等方面進行綜述,以期對CLEAs的商業化生產提供一定的指導作用。

1 CLEAs的大小與形態

粒徑是制備CLEAs的重要參數,它直接決定了CLEAs顆粒的尺寸[10]。合適的尺寸CLEAs不僅有利于產品的分離與回收利用,還能提供最佳的反應物表面積和擴散速度。通常,CLEAs的大小為1～100 μm,按形態分為I型、II型和簇[11-12]。I型CLEAs直徑約為1 μm,如CAL-B,每個CLEA含有8×108個酶分子,呈現球形聚集體,它們主要由低糖基化酶和大疏水表面組成;II型CLEAs直徑小于0.1 μm,由具有大親水性表面和高糖基化水平的酶組成,這種類型的CLEAs中每個CLEA存在大約1×104個酶分子,呈不規則形狀,且小于類型I;CLEAs可能形成較大尺寸(>1 μm)的聚集體,稱為“簇”。簇的形成會存在傳質限制,導致CLEAs內部的酶分子不能很好地與底物接觸,降低CLEAs酶活。然而,CLEAs粒徑過小又會使得酶分子過多地暴露于有機溶劑體系中,不利于酶活性。因此,有必要了解并控制CLEAs大小,為明確調控CLEAs結構和催化性能鋪平道路。

2 粒徑的調控方式

2.1 減少傳質限制

在CLEAs制備中應減少“簇”的形成。增加攪拌速度和攪拌時間來減小CLEAs的大小是實現傳質的增加和保留酶原始活性的常見方法。往復式細胞破碎機和渦流是常采用的減少“簇”傳質限制的方式。渦旋攪拌90 min可以恢復80%的初始活性[13],使用往復式細胞破碎機則可以在30～60 s的處理時間內快速減少CLEAs的大小,從而恢復100%的活性。但在使用往復式細胞破碎機和渦流過程中應注意控制力度以免破壞CLEAs的內部結構。此外,CLEAs顆粒大小也會影響擴散速度,從而影響整個催化反應速率,需對交聯劑/酶的比率進行適當調節。

2.2 調節pH

近年來,不少研究指出CLEAs粒徑也可能會受到pH的影響,這主要與戊二醛(GA)的性質有關。在酸性pH下,水溶液中GA的分子量類似于GA單體的環狀半縮醛,交聯步驟中,這類分子發生的分子間相互作用是短而有序的;而在堿性pH下,GA傾向于聚合形態,這導致在酸性和堿性條件下進行交聯反應得到的最終產物不同[14]。基于上述原理,人們可通過調節pH改變聚集體大小。Caballero等[15]研究了GA溶液pH對粒徑影響,發現在pH4.5和pH9.5下使用GA制備CLEAs存在顯著差異,表明GA溶液pH會對CLEAs結構產生影響,并且還發現這種結構變化對CLEAs活性也有顯著影響(圖2)。

圖2 GA溶液pH4.5和9.5下制備的CLEAs光學顯微鏡照片[15]Fig.2 Optic microscopy photographs of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)using glutaraldehyde at pH4.5 and 9.5[15]注:a為用戊二醛在pH4.5,戊二醛濃度為35 mmol/L和酶/白蛋白比為15時制備的CLEAs;b為用戊二醛在pH9.5,戊二醛濃度為35 mmol/L和酶/白蛋白比為15時制備的CLEAs;圖2右下方的藍線表示100 μm的距離[15]。

2.3 選擇交聯方式

按沉淀與交聯之間的時間段可將交聯分為兩種,一種是將使酶完全沉淀后或沉淀后放置一段時間再交聯,也稱后熟處理;另一種則是在沉淀過程中立即引入交聯劑交聯,這種操作能夠節省時間和成本[16]。從交聯機理上來說,兩種交聯方式的主要區別在于前者是聚集體顆粒表面被交聯,而后者可能涉及到分子在聚集體內部進行交聯。用新鮮(在沉淀后立即交聯)與成熟(在4 ℃下存放7 d后交聯)的青霉素酰化酶(PA)進行交聯酶聚集體制備發現成熟的CLEAs比新鮮CLEAs的尺寸更大,表明聚集體的大小可以通過對PA的共價修飾程度來調節[17]。對于后熟處理而言,該過程涉及長時間的沉淀,可能導致酶活力下降。因此,在實驗過程中需根據實際情況選擇合適的交聯方式。

2.4 調節沉淀劑濃度

沉淀劑濃度會改變聚集體表面的疏水/親水殘基數量發生變化。當沉淀劑濃度增加時,疏水殘基隨之增加,而疏水殘基會傾向于產生1 μm的大孔洞,從而增加CLEAs粒徑。反之親水殘基則會形成0.1 μm的小孔洞,由此影響CLEAs的大小。通過掃描電子顯微鏡發現高飽和度硫酸銨沉淀制得的CLEAs表面孔洞更多,粒徑也更大[18]。

2.5 結合反膠團沉淀

將適量的水和表面活性劑溶于有機溶劑中,并使表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度可形成反膠束,該法可用于酶、蛋白質、核酸等生物活性物質的提取[19]。Chen等[20]首次從二氧化碳分散的反膠束溶液沉淀胰蛋白酶進行交聯,獲得了納米級別的樹狀CLEAs(7～38 nm)(如圖3)。這種方法通過改變水-表面活性劑比例(w0)和酶在反膠束溶液中的濃度使得CLEAs的直徑發生變化,從而精確地控制它們的尺寸。與常規方法相比,此方法制備的CLEAs具有更高活性。

圖3 CO2分散反膠束溶液制備交聯酶聚集體(CLEAs)的TEM照片[20]Fig.3 TEM photographs of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)from the CO2-expanded reverse micellar solutions[20]注:a表示w0=20,胰蛋白酶0.5 mg/mL;表示bw0=40,胰蛋白酶0.5 mg/mL;c表示w0=40,胰蛋白酶1.0 mg/mL[20]。

CLEAs的粒徑不僅影響其微觀結構,同時也與酶活性相關。有研究報道了五種納米粒子(NPs)(納米TiO2,納米MgO,納米Ni,納米Cu和納米Fe3O4)對CLEAs活性和結構的影響,其中添加納米TiO2會使CLEAs顆粒尺寸更小并產生更多的通道,這種結構的改變使CLEAs的Km降低和Vmax增加,從而有利于CLEAs活性。而對于其他四種NPs而言,它們的加入不能形成較多的無定形空腔,反而產生更大或更離散的粒徑,因此CLEAs活性降低[12]。然而,如何精確控制CLEAs的大小實現酶尺寸的定制,目前仍然處于研究階段。

3 改善CLEAs活力的因素

CLEAs活力是評價交聯酶聚集體性能的重要指標,除上述提到的粒徑影響因素外,CLEAs活力還受沉淀劑、交聯劑、酶濃度以及添加劑等多種因素的影響。

3.1 沉淀劑

不同的酶組成的氨基酸序列不同,故采用不同的沉淀劑進行沉淀存在差異[21],因此制備的CLEAs活性也會有所差異。Devi等[22]研究了四種類型的沉淀劑對南極假絲酵母脂肪酶B(CAL-B)CLEAs的影響,發現PEG和飽和硫酸銨沉淀的CLEAs具有優良的活性。脂肪酶CLEAs活性回收率會隨沉淀劑類型和酶來源而發生變化,這是由于不同微生物來源的脂肪酶糖基化表面不同,使用不同的沉淀試劑會形成不同的聚集、包裝和配置蛋白質分子[22-23]。此外,有機溶劑作沉淀劑可能會除去蛋白質表面的水分,導致酶活性降低。有研究[24]提出通過添加葡萄糖、海藻糖和蔗糖物質來輔助沉淀可增強CLEAs在有機溶劑沉淀下的穩定性。最佳沉淀劑并不一定會制備出最佳CLEAs,因為最佳沉淀劑并不意味著能誘導出更有利于酶活性的構象[1]。

3.2 交聯劑

目前,CLEAs中最常使用的交聯劑是GA,因其易商業獲得被廣泛用于水解酶、氧化酶、裂解酶等CLEAs制備。但大量研究發現使用GA作交聯劑并不總能獲得理想的效果。因此有必要研究開發其他交聯劑。

3.2.1 新型交聯劑的開發 Talekar等[25]最早提出用果膠作交聯劑,這種高度生物相容的自然多糖在高碘酸鹽介導的氧化作用下能在單體單元的C2和C3鍵處被特異性切割,形成兩個反應性醛基,這些生成的二醛基團對賴氨酸殘基中的氨基特別活潑,可形成席夫堿,從而替代GA成為一種可再生且無毒的交聯劑[26]。一些溫和的交聯劑如乙二醇-雙[琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺](EG-NHS)可以取代GA制備青霉菌脂肪酶CLEAs,該交聯劑主要通過N-羥基琥珀酰亞胺酯形成穩定的酰胺鍵來交聯蛋白質,制得的EG-NHS聚集體較戊二醛具有更優異的水解和酯化活性[13,27](圖4)。有研究[28]表明CAL-B-CLEA的熱穩定性對所用雙環氧化物的交聯度及鏈長度具有很強的依賴性。苯醌也被報道用作交聯劑,且在50 ℃條件下90 min的熱穩定性比用GA制備的CLEAs高5倍[29]。對于一些酶而言,小分子的交聯劑可能會進入蛋白質內部破壞其三級結構,導致酶活性完全喪失,因此不少研究致力于開發葡聚糖和殼聚糖等大分子制備交聯酶聚集體[30-31]。

圖4 蛋白質(a)經由戊二醛的和(b)乙二醇雙[琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺]交聯Fig.4 Crosslinking of proteins(a)via Glutaraldehyde and(b)Ethylene glycolbis[succinimidylsuccinate]

3.2.2 交聯劑濃度與交聯時間的控制 交聯劑濃度與交聯時間會影響CLEAs活性和穩定性。Majumder等[32]用三種不同濃度(10、40、60 mmol/L)的GA生產CLEAs時發現較高交聯度下熱穩定性增加;但是活性和對映選擇性受損,這是因為CLEAs的形態受交聯度的影響,濃度增加會引起分子剛性程度增大,導致催化活性降低。而交聯時間對CLEAs活性的影響主要在于長時間的交聯會產生交聯過度、粒徑增大、酶活性被掩蓋等問題,而交聯時間過短,則交聯不足,導致CLEAs在浸入水中時過于柔軟且不穩定[33]。因此,在CLEAs制備中,應選擇適宜的交聯劑濃度并合理控制交聯時間,以提高CLEAs的活力。

3.3 酶濃度

酶濃度也是影響CLEAs活性的重要因素。有研究發現在一定的酶濃度(10～40 mg/mL)范圍內熒光假單胞菌脂肪酶CLEAs的活性會隨著酶濃度的增加而增加,這是由于酶濃度的增加會有更多的酶分子被固定[34]。但酶濃度過高會使CLEAs顆粒增大,導致酶的活性中心與底物分子接觸受阻,同時還會降低反應體系中的水分含量使酶分子變性失活。因此,在酶濃度可調節的情況下,應對酶濃度加以選擇,以制備較高活力的CLEAs。

3.4 添加劑

孫立梅[35]，Bashir F[36]等研究表明在蛋白質濃度低的酶制劑中添加牛血清白蛋白可以促進CLEAs形成,這可能涉及到BSA可以提供更多的賴氨酸基團。在CLEAs中添加表面活性劑SDS或庚烷會增加酶的表面積,因為庚烷和疏水性分子可以使CLEAs周圍的水分子重新排列,同SDS一樣起到界面活化作用,使活性位點增加,給予底物提供更好的附著機會[37]。覆蓋酶活性位點的蓋子可在各種印記分子存在的界面處開啟,因此在CLEAs制備中可通過添加油酸印跡增加酶表面殘基之間靜電和氫鍵的相互作用[38],對于酶分子表面含有少量或不含賴氨酸殘基導致交聯不足產生CLEAs不穩定和活力低的現象,可添加伯氨基的聚合物,如聚賴氨酸和聚乙烯亞胺來解決這一問題,同時后者可形成帶正電荷的微環境,能夠阻止有機溶劑與蛋白質之間的接觸,從而提高CLEAs穩定性[39]。Triton X-100的加入會增加傾向于形成二聚體的脂肪酶的活性,例如棉狀嗜熱絲孢菌(TLL),而CAL-B幾乎不受Triton X-100存在的影響[40]。表面活性劑和冠醚對脂肪酶有活化作用,這通常歸因于誘導酶產生了更有利于活性的構象。添加劑不與酶共價結合,因此可以使用合適的有機溶劑將其從CLEAs中輕松沖洗出來,從而使固定化酶保持有利的催化構象[41]。

4 增強CLEA穩定性的策略

4.1 調節實驗參數

大量研究表明CLEAs固定化能夠提高酶的穩定性。但是在不同的商業應用中對CLEAs的穩定性要求存在差異,故需適時做出調整。一般來說,分子間和分子內共價鍵的數量越多,熱穩定性越強。即可通過增加酶的剛性程度來提高穩定性。因此在CLEAs制備期間,可以通過調節交聯時間,交聯劑濃度和交聯劑等實驗參數來提高CLEAs穩定性。Kopp等[42]以叔丁醇做沉淀制備青霉素G酰基轉移酶CLEAs,其熱穩定性高于DME和PEG,董濤等[43]在制備氨基酰化酶交聯聚集體選用叔丁醇做沉淀也得到了類似的結果。此外,在CLEAs制備過程中加入帶電聚合物聚乙烯亞胺(PEI)可增強CLEAs的穩定性,Pan等[44]使用PEI作為共沉淀劑制備粘質沙雷氏菌粘附分枝桿菌脂肪酶與聚乙烯亞胺(CLECAs-SML-PEI)的交聯酶共聚集體,發現熱穩定性有顯著提高。

4.2 氨基酸改善

目前,有研究提出在交聯過程中加入適當的氨基酸可使交聯酶聚集體更穩定,因為當游離氨基酸與蛋白質共存時,氨基酸可通過-NH2或胍基與蛋白質形成交聯,此過程還涉及電荷改變,如加入Arg可以使蛋白質聚集體帶上一個負電荷,而Asp則會使蛋白質聚集體帶上多個負電荷[45]。而且每個氨基酸的加入都會在不同程度上增加側鏈中的-(CH2)n,而戊二醛在溶液中也會形成-(CH2)n,導致同時交聯[46]。Mukherjee等[47]研究了Arg,Lys,Ala,Asp對幾種脂肪酶的影響,發現在形成CLEAs期間添加氨基酸能使生物催化劑更穩定。然而,不同的蛋白質的疏水化和親水化存在差異,且在某些情況下交聯可能是通過胍基而不是Lys形成[44-48],因此對不同來源和類型的酶在CLEAs制備中,我們應據實際情況選擇合適的氨基酸來進行化學修飾。

4.3 結合其他固定化技術制備CLEAs

4.3.1 分子篩載體CLEAs制備 在聚合物或基質中對CLEAs進行包封能夠增加其穩定性。Wilson等[44]將青霉素酰基轉移酶CLEAs包封在聚乙烯醇水凝膠內能夠顯著提高穩定性。采用先吸附后交聯的方法可在二氧化硅基質的內孔中制備胰凝乳蛋白酶和爪哇毛霉脂肪酶CLEAs,這些37 nm小孔通過直徑為13 nm的通道連接,使得CLEAs不能通過該通道并保留在毛孔中。并且為防止載體CLEAs的浸出和抑制糜蛋白酶自溶,該實驗在200 r/min下攪拌2周以研究CLEAs的穩定性,發現酶活基本沒有降低[49]。國內也有研究報道了將CLEAs與氨基化硅膠共價交聯來提高CLEAs的重復使用性和儲藏穩定性[50]。黎克純等[51]使用大孔的菲環骨架為載體固定交聯淀粉酶聚集體,使其熱穩定性和儲存穩定性都顯著提高,而且在重復反應7批次后,相對活性仍保留63.29%。

4.3.2 磁性CLEAs制備 將CLEAs用二氧化硅包埋后交聯到磁珠上可提高穩定性[52]。最近,國內有研究者采用無官能修飾的納米Fe3O4制備出了磁性納米交聯酶聚集體(M-CLEAs),并將其用于微管式反應器中實現了油酸丁酯合成和柴油廢水降解[53]。Nadar[54]等采用果膠作交聯劑將葡糖淀粉酶固定在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)上形成磁性納米顆粒。鼠李糖吡喃糖苷酶磁性交聯酶聚集體(mCLEAs)的開發在糖類化合物生產中具有重要作用,且在微型填充床生物反應器中,mCLEAs最大體積生產力可達到140 μmol/L·h[55]。此外,磁性CLEA也被用于Combi-CLEAs的制備中并成為當下研究的主要熱點之一,因為磁性Combi-CLEAs不僅具備一個強大的生物轉化系統,而且很好的解決了Combi-CLEAs不易復原的問題,使其成為工業生物催化工具的新選擇[56]。

5 結論與展望

CLEAs技術廣泛應用在食品、制藥、化工等領域。其固定化酶具有許多優點:制備簡單,優化速度快,且能以粗酶為原料而無需純化,CLEAs大都呈現出較好的熱穩定性和有機溶劑的耐受性;同時該技術適用于制備含有兩種或多種酶的Combi-CLEAs,可以有利地用于催化級聯過程。在微通道反應器中使用CLEAs具有明顯的快速篩選和優化的潛力。然而,目前大多數研究仍集中于CLEAs的制備和現象描述,因此,在此基礎上提出以下幾點建議:a.開發并探究新的交聯劑,實現酶活力穩定性的進一步改善和各種交聯酶聚集體的開發;b.對CLEAs技術影響酶催化效率的深層機理進行探究,實現從現象描述到深層機理的研究;c.建立包含各種酶及與之對應的沉淀劑、交聯劑,添加劑等各因素的數據庫,為減少優化和精確調控各因素實現CLEAs定制提供快速、充分、可靠的技術平臺支持。