LAMP實時濁度法快速檢測食品中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌

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(珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東珠海 519000)

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一種重要的食源性致病菌,能夠分泌志賀毒素、引起宿主腸黏膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷,有些STEC在臨床上引起人類出血性結(jié)腸炎或血性腹瀉,并可進一步發(fā)展為溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS),這部分STEC被稱為腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)[1]。1982年美國首次報道分離出STEC O157∶H7,STEC在世界上許多國家引起了大規(guī)模暴發(fā)和流行,已成為危及全球性公共衛(wèi)生的問題之一。2011 年5月至7月德國發(fā)生的STEC O104∶H4感染暴發(fā)疫情,波及部分歐洲其他國家及美國、加拿大等國家,HUS 報告病例數(shù)表明,這也是迄今為止全球范圍內(nèi)規(guī)模最大的EHEC食源性疾病暴發(fā)事件[2]。

志賀毒素是STEC引發(fā)疾病的關(guān)鍵毒力因子,包括志賀毒素1(Stx1)和志賀毒素2(Stx2)兩類毒素,分別由stx1基因和stx2基因編碼。志賀毒素基因是STEC的共有特征,使得通過核酸擴增試驗檢測志賀毒素基因?qū)TEC進行快速篩檢成為行之有效的方法[1]。STEC的檢測可用以下3種方法分別為:檢測樣品對Vero細胞的毒性;通過抗原抗體反應(yīng)進行免疫檢測測定志賀毒素;核酸擴增試驗檢測stx1和stx2基因。Vero細胞毒性試驗可以準確判定菌株產(chǎn)志賀毒素生物學(xué)活性的強弱,是檢測STEC是否具有志賀毒素生物學(xué)活性的金標(biāo)準方法,白莉等[3]對核酸擴增檢測毒素基因的方法(stx-PCR)、Vero細胞毒性試驗和酶聯(lián)免疫試劑盒這3種方法在檢測產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的特異性和敏感性的差異進行了比較研究,結(jié)果表明3種方法都具有很好的特異性,stx-PCR方法和Vero細胞毒性試驗較酶聯(lián)免疫試劑盒敏感性更高,由于PCR方法可以彌補Vero細胞毒性試驗周期長的缺點,推薦PCR方法作為實驗室常規(guī)快速檢測方法。

STEC的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法包括增菌、分離、生化與血清學(xué)鑒定等步驟,工作量大、檢測周期長、費用高,準確度、檢出率、靈敏度不盡如人意,在實際應(yīng)用中大大受限。以PCR技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)方法的不足,在應(yīng)對食品安全重大爆發(fā)事件其優(yōu)勢充分體現(xiàn),如2011年5月至7月德國發(fā)生的STEC O104∶H4暴發(fā)事件中德國負責(zé)疾病防控與公眾健康的權(quán)威機構(gòu)-羅伯特·科赫研究所(Robert Koch Institute,RKI)和我國疾病預(yù)防控制中心應(yīng)對這一緊急事件均應(yīng)用了PCR技術(shù)[4-5]。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技術(shù)是日本學(xué)者Notomi[6]2000年等發(fā)明的一種新型等溫核酸擴增法,為基因快速檢測提供了一種新的技術(shù)途徑。LAMP采用4條特異性引物結(jié)合6個靶目標(biāo)區(qū)域,比PCR特異性更強,閉管反應(yīng)、不需電泳分析,避免了氣溶膠的產(chǎn)生、不易污染,檢測效率高,通常60 min左右可完成。LAMP實時濁度法通過實時濁度儀實時監(jiān)測反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物白色磷酸鎂沉淀,實現(xiàn)對擴增全過程的實時監(jiān)控,比LAMP終點法(顯色肉眼觀察法)引物篩選的效率更高、結(jié)果判定的準確性更強[7]。本研究使用的日本榮研生物公司的LA-320C型LAMP實時濁度儀可在啟動LAMP反應(yīng)后每間隔6秒檢測一次濁度,在儀器的Judgment模式下軟件可按動態(tài)濁度平均值差異(即濁度增量)相對反應(yīng)時間形成反應(yīng)峰形曲線,可高效地用于LAMP檢測反應(yīng)的優(yōu)化和選擇[8-9]。本研究旨在針對STEC的stx1基因和stx2基因設(shè)計LAMP引物,建立LAMP實時濁度快速檢測方法,并對方法的特異性、靈敏度及穩(wěn)定性進行評估,并在實際樣品檢測中進行應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用菌株如表1所示;營養(yǎng)肉湯、李氏增菌肉湯、布氏肉湯 北京陸橋技術(shù)有限公司;Bst大片段DNA聚合酶 New England Biolabs公司;dNTPs、MgCl2寶生物工程(大連)有限公司;甜菜堿(Betaine) 廣州威佳生物有限公司;DNA 提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;畜產(chǎn)品192份、水產(chǎn)品67份、禽產(chǎn)品45份、可生食蔬菜59份、其它食品32份 部分購自珠海本地集貿(mào)市場、超市,部分為珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心受理的委托檢驗樣品。

表1 試驗用菌株Table 1 Strains used in the experiment

LA-320C型LAMP實時濁度儀 日本榮研生物公司;MB-102型振蕩型恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司;Gel Doc EQ型凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;ND-1000型核酸濃度測定儀 美國NanoDrop科技有限公司;MARK II型智能厭氧系統(tǒng) 荷蘭MART公司;1565-2E型恒溫培養(yǎng)箱 美國SHELLAB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計和合成根據(jù)LAMP 引物設(shè)計的原則,針對GenBank公布的STEC的stx1基因和stx2基因序列,使用在線設(shè)計軟件LAMP Designer設(shè)計特異引物,經(jīng)篩選分別獲得一套特異性引物(見表2),由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表2 STEC的stx1基因和stx2基因擴增用LAMP引物序列Table 2 Primer sequences used in LAMP for stx1 gene and stx2 gene of STEC

1.2.2 細菌DNA模板的制備、濃度和純度測定 各菌株分別按下述培養(yǎng)方法獲得指數(shù)生長期新鮮培養(yǎng)物:大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌接種營養(yǎng)肉湯,36 ℃培養(yǎng)24 h;單核細胞增生李斯特菌接種李氏增菌肉湯,30 ℃培養(yǎng)24 h、副溶血性弧菌接種3%氯化鈉堿性蛋白胨水,36 ℃培養(yǎng)18 h;空腸彎曲菌于接種布氏肉湯,智能厭氧系統(tǒng)提供微需氧環(huán)境后于42 ℃培養(yǎng)48 h。用DNA提取試劑盒按其說明提取制備DNA模板。核酸濃度測定儀測定出DNA濃度與純度,OD260/OD280比值在1.6～1.9之間表明DNA純度較高,可用于LAMP擴增。

1.2.3 LAMP初始反應(yīng)體系的反應(yīng)條件 以STEC的stx1基因和stx2基因陽性對照菌株-大腸埃希氏菌ATCC 35150的DNA 作為模板,25 μL的LAMP反應(yīng)體系包括:FIP和BIP各1.6 μmol/L,F3和B3各0.2 μmol/L,Tris-HCl(pH8.8)20 mmol/L,KCl 10 mmol/L,MgSO48 mmol/L,(NH4)2SO410 mmol/L,Tween200.1%,甜菜堿1 mol/L,MgSO46 mmol/L,dNTP 1.6 mmol/L,8U BstDNA聚合酶,2 μL DNA。參照LAMP濁度儀使用說明書,將混合物置于反應(yīng)孔中,于65 ℃恒溫反應(yīng)90 min,最后80 ℃下保溫5 min結(jié)束反應(yīng),擴增反應(yīng)濁度增量曲線峰值超過 0.1 時判定為陽性。

1.2.4 LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別對反應(yīng)溫度(60.0、61.0、62.0、63.0、64.0、65.0 ℃),Mg2+濃度(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mmol/L),甜菜堿濃度(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mol/L),dNTP濃度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L),外引物與內(nèi)引物濃度比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)進行優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化實驗。根據(jù)LAMP 濁度法中擴增反應(yīng)濁度增量曲線的出峰時間、峰值及峰形作為評價指標(biāo),確定最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.5 LAMP特異性試驗 將表1中所有菌株的各菌株指數(shù)生長期新鮮培養(yǎng)物分別制備DNA模板,按FIP 和BIP 各1.6 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO48 mmol/L、(NH4)2SO410 mmol/L、Tween20 0.1%、甜菜堿0.8 mol/L、dNTP 1.4 mmol/L、8U Bst DNA聚合酶、2 μL DNA的反應(yīng)體系在63 ℃恒溫反應(yīng)90 min、80 ℃ 5 min 結(jié)束反應(yīng)進行LAMP擴增,以驗證STEC的stx1基因和stx2基因LAMP擴增方法的特異性。

1.2.6 LAMP靈敏度試驗 將提取的大腸埃希氏菌ATCC 35150的DNA進行10倍連續(xù)遞增稀釋至10-7濃度,將各DNA核酸稀釋液2 μL分別按FIP和BIP各1.6 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO48 mmol/L、(NH4)2SO410 mmol/L、Tween20 0.1%、甜菜堿0.8 mol/L、dNTP 1.4 mmol/L、8U Bst DNA聚合酶、2 μL DNA的反應(yīng)體系在63 ℃恒溫反應(yīng)90 min、80 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)進行LAMP擴增,確定LAMP方法的靈敏度。

1.2.7 LAMP穩(wěn)定性試驗 大腸埃希氏菌ATCC 35150的DNA模板2 μL用于LAMP實驗,以超純水代替DNA模板作為空白對照,按FIP和BIP各1.6 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO48 mmol/L、(NH4)2SO410 mmol/L、Tween20 0.1%、甜菜堿0.8 mol/L、dNTP 1.4 mmol/L、8U Bst DNA聚合酶、2 μL DNA的反應(yīng)體系在63 ℃恒溫反應(yīng)60 min、80 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)進行7次重復(fù)實驗,驗證該方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 食品樣品檢測 無菌稱取食品樣品25 g至帶濾網(wǎng)無菌拍擊式均質(zhì)袋加入225 mL滅菌EC肉湯,拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min,恒溫培養(yǎng)箱36 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取帶濾網(wǎng)拍擊式均質(zhì)袋中培養(yǎng)物濾過液按熱裂解法提取核酸:1 mL培養(yǎng)物濾過液于1.5 mL離心管12000 r/min離心5 min,棄上清,加DNA裂解液50 μL,100 ℃金屬浴裂解5 min,冷卻后12000 r/min離心5 min,上清按照優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)條件進行擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP實時濁度法反應(yīng)體系的建立

在LAMP初始反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下采用STEC的stx1基因和stx2基因陽性對照菌株--大腸埃希氏菌ATCC 35150進行LAMP實時濁度法擴增,LAMP法擴增的實時濁度增量圖見圖1。由圖1可見,大腸埃希氏菌ATCC 35150的stx1基因、stx2基因擴增反應(yīng)的濁度增量曲線均呈現(xiàn)顯著峰形圖,達到峰值超過 0.1的陽性判定標(biāo)準,可判斷2個靶基因均實現(xiàn)了有效擴增。

圖1 大腸埃希氏菌ATCC 35150的stx1基因、stx2基因LAMP初始擴增圖Fig.1 LAMP detection of stx1 gene and stx2 gene in E. coli ATCC 35150 in initial condition

2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)LAMP濁度法中擴增反應(yīng)曲線的出峰時間、峰值及峰形作為評價指標(biāo),得到最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:FIP和BIP各1.6 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO48 mmol/L、(NH4)2SO410 mmol/L、Tween 20 0.1%、甜菜堿0.8 mol/L、dNTP 1.4 mmol/L、8U Bst DNA 聚合酶、2 μL DNA的反應(yīng)體系在63 ℃恒溫反應(yīng)90 min、80 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)。在優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下大腸埃希氏菌ATCC 35150的stx1基因、stx2基因擴增圖見圖2。與圖1中初始擴增圖相比，stx1基因、stx2基因出峰時間更早、峰值更高、峰形更集中,其中stx1基因出峰時間由54 min明顯提前、縮短至40 min,2個靶基因經(jīng)最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化擴增效率均有所提高,恒溫擴增步驟可在60 min內(nèi)完成。

圖2 大腸埃希氏菌ATCC 35150在優(yōu)化條件下stx1基因、stx2基因LAMP擴增圖Fig.2 LAMP detection of stx1 gene and stx2 gene in E. coli ATCC 35150 in the optimum condition

2.3 LAMP特異性試驗

將表1中所有菌株的各菌株按優(yōu)化出的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別進行stx1基因和stx2基因的LAMP實時濁度法擴增。stx1基因的LAMP特異性試驗僅大腸埃希氏菌ATCC 35150、CCTCC AB 20051和ECO157-stx1呈現(xiàn)陽性擴增,stx2基因的LAMP法僅大腸埃希氏菌ATCC 35150、CCTCC AB 20051和ECO157-stx2呈現(xiàn)陽性擴增;其余菌株擴增結(jié)果均為陰性。stx1基因和stx2基因LAMP實時濁度法擴增的特異性擴增圖見圖3、圖4,由圖可見stx1基因和stx2基因LAMP特異性均良好。

圖3 stx1基因LAMP特異性試驗Fig.3 Specificity test for LAMP detection of stx1 gene

圖4 stx2基因LAMP特異性試驗Fig.4 Specificity test for LAMP detection of stx2 gene

2.4 LAMP靈敏度試驗

菌株的DNA經(jīng)核酸濃度測定儀測得其濃度為30 ng/μL,菌株DNA原液和7個連續(xù)10倍梯度的DNA稀釋液各2 μL用于擴增,E.coli基因組大小為0.004 pg/copy,菌株DNA原液模板相當(dāng)于15000000 copies,菌株DNA 7個連續(xù)10倍連續(xù)遞增稀釋的稀釋液檢測stx1基因和stx2基因的靈敏度試驗濁度增量擴增曲線見圖5和圖6。由圖5和圖6可知,本方法的stx1基因和stx2基因檢測靈敏度均可達150 copies/反應(yīng)。

圖5 stx1基因LAMP靈敏度試驗Fig.5 Sensitivity test for LAMP detection of stx1 gene

圖6 stx2基因LAMP靈敏度試驗Fig.6 Sensitivity test for LAMP detection of stx2 gene

2.5 LAMP穩(wěn)定性試驗

大腸埃希氏菌ATCC 35150的DNA模板的7次LAMP擴增反應(yīng)stx1基因、stx2基因的濁度增量擴增曲線見圖7和圖8,2個靶基因均出現(xiàn)陽性擴增,擴增濁度增量曲線峰形及重復(fù)性較好,且超純水空白對照均無擴增,表明該方法用于STEC的stx1基因、stx2基因擴增的穩(wěn)定性良好。

圖7 stx1基因LAMP穩(wěn)定性試驗Fig.7 Stability test for LAMP detection of stx1 gene注:CH1～7 DNA模板-大腸埃希氏菌 ATCC 35150;CH8-超純水空白對照;圖8同。

圖8 stx2基因LAMP穩(wěn)定性試驗Fig.8 Stability test for LAMP detection of stx2 gene

2.6 食品樣品檢測

所檢395份食品樣品STEC檢測結(jié)果見表3。由表3可知,395份食品樣品檢出STEC陽性樣品數(shù)68份,STEC檢測陽性率為17.2%,陽性樣品包括stx1基因陽性6份,stx2基因陽性54份,stx1基因、stx2基因同時陽性的樣品8份,可見樣品中STEC污染中以stx2基因陽性型為主。結(jié)合樣品類型分析,所檢畜產(chǎn)品共計192份,陽性率高達31.3%,為所有樣品類別中陽性率最高者,禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品和可生食蔬菜均有少量陽性樣品檢出,陽性率為3.0%～6.8%,其它食品32份包括腌制蔬菜、豆制品、調(diào)味品等未檢出陽性樣品。

表3 食品樣品STEC檢測陽性結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistics analysis for positive results of stx1 and stx2 gene in food samples

3 結(jié)論

本研究建立的LAMP實時熒光濁度法檢測靈敏度高,對stx1基因、stx2基因均能檢測到150 拷貝/反應(yīng)。本檢測方法對4株不同STEC菌株的stx1基因、stx2基因特異性擴增結(jié)果與各自基因型一致,未出現(xiàn)非特異性擴增,表明本研究的LAMP法對stx1基因、stx2基因擴增具有良好的特異性。

STEC是一類重要的人獸共患食源性致病菌,許多國家的生肉、肉制品、乳品、蔬菜水果等都存在不同程度的STEC污染,牛、羊、豬等被證明是STEC的主要宿主,食用被污染的食品尤其是動物性食品(肉類)是人感染STEC的重要途徑[10-13]。本研究食品樣品STEC檢測結(jié)果表明,食品中STEC的污染較為普遍,其分布與食品基質(zhì)存在一定關(guān)系,所檢395份食品樣品中以畜類產(chǎn)品的陽性率最高(達31.3%),禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品和可生食蔬菜均有少量陽性樣品檢出,樣品中STEC污染中以stx2基因陽性型為主,這與研究報道的攜帶stx2的STEC數(shù)量明顯高于stx1較為一致[14-16]。

綜上所述,本研究建立的LAMP實時熒光濁度法可快速、特異、靈敏地檢測食品中的STEC,可滿足對食品中STEC的快速篩查的需求,食品樣品STEC污染檢測結(jié)果為食品安全監(jiān)控提供了有利依據(jù)。