基于厭氧環境的低鹽雪菜揮發性風味物質分析

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(浙江省農業科學院食品科學研究所,浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310021)

雪菜,又名雪里蕻(Brassicajunceavar. crispifolia),屬十字花科蕓薹屬,是芥菜的變種,也稱為葉用芥菜[1],在我國南北各地均有種植,尤其在江浙一帶廣為栽培。雪菜經腌制后,香氣四溢,滋味鮮美,是腌漬蔬菜中最受歡迎的產品之一。

我國的漬菜腌制是依靠傳統的食鹽高滲透壓進行,含鹽量高達13%～15%。當前我國對腌漬菜低鹽化尚無統一的評判標準。例如,我國第一個低鹽泡菜地方標準“四川泡菜”規定泡菜的食鹽含量≤4%,而榨菜行業標準規定的低鹽榨菜標準含鹽量≤7%[2],低鹽發酵辣椒食鹽含量≤8%[3]。在漬菜腌制過程中,調節鹽分含量可達到調節脂質氧化及風味形成的目的[4-5]。腌制時,由于食鹽產生滲透、擴散和吸收等物理現象而造成了原輔料之間的成分置換,同時借助微生物的發酵作用所產生的一系列生化學變化形成了腌制蔬菜特定的風味[6-7]。評價腌制蔬菜品質的指標有色澤形態、香氣、質地、滋味等,一般認為優質腌制雪菜具有特有的香氣,色黃、味鮮、有脆性[8]。

在企業生產加工中,由于生產周期的需要,雪菜采用高鹽保存,包括目前的低鹽產品也是高鹽坯料經脫鹽加工而成的。高鹽可以使雪菜得以較長時間的保存,但是高鹽容易產生高化學需氧量的鹵水排放,導致河水及農田受到嚴重污染[9-10]。另外,高鹽雪菜在加工過程中需要脫鹽脫水等環節而導致加工工藝耗工費時、成本增加、風味與營養物質大量流失等,且高鹽在腌制時亞硝酸鹽生成較慢,亞硝峰出現晚,峰值高[11]。因此腌制蔬菜的低鹽化處理越來越受到人們的青睞。但若僅依靠低鹽,其最直接的結果是降低了滲透壓對有害微生物的抑制作用,使雪菜易受有害微生物的侵染,影響了雪菜發酵過程中微生物的群落結構[12],將直接或間接地影響雪菜的風味和品質。

因此,本研究為了降低雪菜腌制過程中的用鹽量,改變傳統漬菜腌制坯料長久不變的高鹽保存模式,以CO2或N2厭氧條件下的低鹽雪菜以及傳統的高鹽雪菜為研究對象,分析了厭氧環境下雪菜中揮發性風味物質,結果可為厭氧條件長效保存與發酵提供指導,為改善我國傳統腌制蔬菜的工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪菜(Brassicajunceavar. multiceps)、食鹽(食用級) 市售;CO2、N2純度99.995%,杭州今工特種氣體有限公司。

固相微萃取器手柄、SPME裝置、65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)萃取頭 美國Supelco公司;Trace DSQ GC-MS型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan質譜公司;透明EVOH包裝材料(透氧率為1.2 g/m2/d) 江蘇省昆山市華億塑料有限公司;CYES-Ⅱ型氧、二氧化碳氣體測定儀 上海精勝科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同鹽量低鹽雪菜腌制 以雪菜作為原料,在腌制池中進行腌制。采用傳統腌制方法,即一層菜體一層鹽,用鹽總量分別為7%(低鹽)、14%(高鹽),壓實雪菜,最上層用重石壓實,保存3個月。

1.2.2 厭氧條件下低鹽雪菜腌制 選用一端開口的EVOH薄膜袋套在腌制容器中,開口的下沿部位打孔后安裝充排氣開關,雪菜按照1.2.1的方法鹽腌制。采用CO2或N2氣體調節厭氧環境,先用真空泵抽出EVOH薄膜袋中的空氣并充入CO2或N2氣體,并反復若干次直至袋中的壓力達到0.06 MPa,袋中CO2或N2氣體濃度達95%～98%時止。采用二氧化碳氣體測定儀進行監測,當氣體濃度不足時,充入氣體并達到濃度要求。

1.2.3 HS-SPME-GC/MS分析腌制雪菜中的揮發性組分 采用頂空固相微萃取法(headspace solid-phase micro-extraction,HS-SPME)。取腌制3個月的不同部位各2 g,混合于10 mL的萃取瓶中,插入經老化的萃取頭(DVB/CAR/PDMS,50/30 μm),于60 ℃水浴條件頂空下萃取30 min后氣相色譜-質譜聯用儀(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)進樣,解析時間為5 min。

色譜條件:石英毛細管柱,CP-Wax52CB(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:40 ℃ 保持2 min,以5 ℃/min升溫至100 ℃,保持2 min;再以10 ℃/min上升到250 ℃,進樣口溫度:250 ℃;載氣He,流速1 mL/min。

質譜條件:電離方式EI,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度250 ℃。掃描質量范圍45～300 amu。

GC-MS試驗數據由Xcalibur 軟件處理,未知化合物經計算機檢索同時與 NIST譜庫和Wiley譜庫相匹配,只有當正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結果才予以確認。按峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3 數據處理

雪菜中主要揮發性成分通過Excel 2013軟件進行匯總處理后導入SPSS 18.0 軟件進行數據處理,根據各揮發性化合物種類的相對含量,采用CANOCO 4.5統計軟件進行PCA主成分分析,比較不同處理與雪菜揮發性物質的相關性。

2 結果與分析

2.1 厭氧環境下低鹽雪菜揮發性成分的GC-MS鑒定

對厭氧環境下的4組雪菜進行SPME-GC-MS分析,得到其總離子色譜圖,見圖1。

圖1 雪菜揮發性成分GC-MS總離子色譜圖 Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of potherb mustard(Brassica juncea var.)注:A:低鹽;B:高鹽;C:低鹽CO2厭氧;D:低鹽N2厭氧。

不同揮發性化合物出峰時間見圖1。由圖1可以看出,不同雪菜揮發性成分出峰時間和離子強度差異較大,表明不同樣品間揮發性化合物差異大。總離子流圖中各峰經質譜掃描后所得的質譜圖,按各峰的質譜裂片與文獻核對,采用計算機進行質譜數據庫檢索以及人工譜圖解析,經綜合分析鑒定,不同雪菜中揮發性物質種類及相對含量檢測結果見表1。

表1 雪菜中揮發性物質SPME-GC-MS分析結果Table 1 SPME-GC-MS analysis results of volatile compounds

續表

由表1可知,從采用高鹽、低鹽、低鹽厭氧(CO2或N2)處理的4組雪菜中分別鑒定出46、40、46和44種揮發性化合物,峰面積之和分別占總離子流色譜峰面積的91.12%、79.29%和84.17%、88.09%。揮發性化合物包括酯類、醛類、醇類、酸類、烴類、酮類和其他雜環化合物,其共同構成了雪菜的整體風味。4組雪菜揮發性物質分類如圖2。

圖2 厭氧環境對雪菜揮發性風味種類含量的影響 Fig.2 Different classes of volatile compounds from (Brassica juncea var)based on Anaerobic Environment

2.2 厭氧環境對雪菜主要揮發性風味物質的影響

2.2.1 對酯類化學物的影響 由表1和圖2可知,分別采用低鹽、高鹽、厭氧低鹽(CO2或N2)處理的4組雪菜中,酯類物質分別被檢出11、7、12和8個,相對含量分別為44.97%、40.45%、37.00%和21.8%。由此可見,采用低鹽量保存的雪菜酯類物質相對含量最高,且采用低鹽量和低鹽量CO2厭氧保存的雪菜酯類物質個數最多,而采用低鹽N2厭氧保存的雪菜酯類物質相對含量最低,比低鹽組減少了23.17%,低鹽組與高鹽組兩者相差僅為4.52%。采用高鹽、低鹽和低鹽CO2厭氧3組處理的雪菜中異硫氰酸酯類化合物均檢出3個,相對含量最高,分別為32.72%、32.97%、16.02%,分別占雪菜中酯類物質的72.75%、81.50%和43.29%,為腌制雪菜的最主要揮發性物質。

雪菜莖葉中存在次生代謝產物GS,根據其側鏈R基團來源不同可以將GS分為脂肪族、芳香族和吲哚族3大類[13]。不同種類的GS在硫苷酶作用下產生異硫氰酸酯類(isothiocyanates,ITCs)、腈類(nitriles)、硫氰酸酯類(thiocyanates,TCs)、環腈類、惡唑烷酮類化合物等,GS也能在微生物的作用下有效降解[14]。GS與硫苷酶反應需在有水存在的情況下進行,其酶降解是復雜的多途徑降解反應過程。雪菜腌制過程中,環境因子和條件(pH、溫度、時間)等因素共同決定了GS降解后產物的類型,依據主要降解產物可將其降解過程主要分為異硫氰酸酯、腈類與硫氰酸酯途徑等3個方面(見圖3)。異硫氰酸酯類(ITCs)為雪菜腌制過程中GS的主要酶解產物,雪菜在腌制的初期或早期,由于產生偏中性條件(pH5-8),硫苷酶水解GS生成的糖苷配基發生洛森重排反應后形成ITCs,同時ITCs的生成受GS上R基團影響,水解產生相應的具有揮發性的ITCs[15]。從GS的降解途徑中可以解析為什么在雪菜揮發性物質中檢測出吲哚以及部分腈類物質。

圖3 硫苷酶解的主要降解產物[13]Fig.3 Main products of glucosinolates enzymatic degradation

近年來,越來越多的研究認為部分特定微生物也參與了GS的降解,如乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等[16]。早在20多年前,有學者就分離出了3種能降解GS的乳酸菌,并發現保加利亞乳酸桿菌能將GS分解成乳酸和異硫氰酸烯丙酯[17]。進一步研究發現植物乳桿菌和乳酸乳球菌等乳酸菌能分解30%～33%的GS,并生成腈類物質[16],表明乳酸菌在GS降解過程中發揮著重要作用。采用低鹽N2厭氧保存的雪菜酯類物質相對含量低而腈類物質相對較高,可能是GS在N2的環境中其降解途徑是偏向于腈類;另一方面,由于無氧環境抑制了好氧微生物的生長而有利于乳酸菌的生長,漬液pH較低鹽量組和高鹽量組低,也有利于向GS腈類物質途徑降解(圖3)。

2.2.2 醛醇類化合物 醛醇類化合物一般是酯質的降解產物,都具有香氣。由表1和圖2可知,分別采用低鹽、高鹽和低鹽厭氧處理(CO2或N2)的4組雪菜中,醛醇類化合物分別被檢出12、9、10和10個,相對含量分別為19.2%、17.32%、18.44%和33.22%,采用低鹽N2厭氧處理的雪菜中醛醇類化合物較其他組均高。在檢出的醛醇類化合物中,苯甲醛、苯乙醇的在4組雪菜中含量均為最高,而苯甲醛等具有玫瑰花香、蜂蜜香,可能來源于雪菜乳酸菌對氨基酸的代謝[18]。

2.2.3 酸類化合物 發酵蔬菜中酸類物質是乳酸菌發酵的主導產物[19-20],也是構成發酵蔬菜特殊香味主體的物質。4組雪菜中,低鹽、高鹽、低鹽厭氧組(CO2或N2)酸類物質分別被檢出7、6、9和8個,相對含量分別為7.62%、7.44%、15.88%和10.24%。十一烯酸、棕櫚酸、十三烷酸在4組雪菜中均檢出,肉豆蔻酸和2-丁烯二酸則均從兩組厭氧環境雪菜中檢出,且含量相對也較高,這可能和厭氧所形成的環境有關。

2.2.4 甲基硫化物類化合物 甲基含硫類化合物為腌制類蔬菜的特征類化合物,特別是以蘿卜和芥菜類為原料的腌制蔬菜制品。在腌制過程中,一些芥子苷被芥子苷酶分解成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等硫醚化合物[21-22]。試驗中檢測出2種含硫類化合物,即在腌制蘿卜中最常見的二甲基二硫和二甲基三硫,但是4組雪菜中其相對含量差異較大,分別為8.02%、0.7%、1.84%和0.83%。采用低鹽保存組,含硫類化合物相對含量最高,其他組相對較低,高鹽環境或者無氧環境抑制了微生物的繁殖及細胞破壞作用,減緩芥子苷的降解過程,從而使芥子苷降解產物在種類及相對含量上均比低鹽腌制產品少。

2.2.5 烷、烴及其雜環類化合物 烷烴及其雜環類化合物在4組雪菜揮發性物質中相對含量分別為9.95%、12.2%、8.77%和12.94%,其中烯烴類化合物檢出較低,雜環類物質主要為吡嗪、呋喃和萘等物質,其具有堅果香等溫和的香味,雜環化合物的存在對泡菜整體風味的形成具有協同作用[23]。

2.3 雪菜揮發性化合物種類差異性分析

以4組雪菜和10類揮發性成分的相對含量為數據源進行差異性分析,結果見圖4。圖中箭頭所處的象限表示影響因素與排序軸之間的正負相關性,箭頭連線的長度代表著某個因子與研究對象分布相關程度的大小,連線越長,代表這個因子對研究對象的分布影響越大,箭頭連線與排序軸的夾角代表這某個因子與排序軸的相關性大小,夾角越小,相關性越高[24],即當為銳角時表示兩者之間呈正相關關系,鈍角時呈負相關關系。圖4中的PC1(82.3%)和PC2(12.5%)累計方差貢獻為94.8%,能夠反映樣本的大部分信息,因此選取前兩個主成分(PC1-PC2)進行分析。由圖4可知,不同處理方式保存的雪菜樣本分別聚集在PCA得分圖的不同區域。采用低鹽組和高鹽組保存的雪菜樣本位于圖的左下象限,而且距離間隔較小,表明這2個樣本的相似性最大;低鹽CO2厭氧保存雪菜樣本位于圖的左上方,但與低鹽組和高鹽組樣本位于坐標軸同側,反映了這3個樣本之間有一定的相似性;低鹽N2厭氧保存雪菜樣本位于圖的右下象限,與其他3個樣本距離較遠,說明與其他3個樣本的相似性較小。圖4也反應了不同處理樣本與其揮發性化合物間的相關性。從圖中可以看出,雪菜揮發性物質中,脂類、醇類、酸類和醛類與不同鹽量與保存方式相關。

圖4 不同處理雪菜揮發性化合物種類主成分分析Fig.4 Difference of volatile components in potherb mustard(Brassica juncea var)of different raw materials

3 結論

本實驗運用頂空固相微萃取-氣質聯用(SPME-GC-MS)對高鹽、低鹽、低鹽厭氧(CO2或N2)4組不同處理的雪菜中揮發性化合物進行了研究。在4組雪菜中共檢測出46、40和46、44種揮發性化合物,主要包括酯類、醛醇類、酸類、烷烴及其雜環類物質,其共同構成了雪菜的整體風味。異硫氰酸酯類化合物為低鹽、高鹽和低鹽CO2厭氧處理雪菜中最主要揮發性物質。雪菜揮發性化合物種類差異性分析表明,脂類、醇類、酸類和醛類化合物與不同鹽量、保存方式相關。