冬蟲夏草水提物HPLC指紋圖譜及模式識(shí)別分析

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(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510275;3.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽550018)

冬蟲夏草是一種蟲生子囊真菌,主產(chǎn)于青藏高原海拔3000～5000 m的高寒草甸地區(qū)[1],是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有保肺、益腎、止血、化痰等功效,主要用于腎虛精虧,陽萎遺精,腰膝酸痛,久咳虛喘等癥[2]。由于生長環(huán)境嚴(yán)苛,生長周期長,加之過度采挖,造成冬蟲夏草資源稀缺,價(jià)格昂貴,因此市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種混淆品,如蛹蟲草、亞香棒蟲草和冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體等,它們與冬蟲夏草相似性較高,采用目前《中國藥典》中的性狀鑒別和腺苷含量測(cè)定法難以有效區(qū)分[3-4],藥材誤用混用現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生,嚴(yán)重影響了冬蟲夏草臨床使用的安全性和有效性。因此,建立一種能有效鑒別冬蟲夏草與其類似品的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,對(duì)規(guī)范冬蟲夏草藥材市場(chǎng)十分必要。

中藥HPLC指紋圖譜是一種針對(duì)復(fù)雜組分的分析方法,根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)組成特征使用特定方法進(jìn)行分離并測(cè)定,具有同時(shí)關(guān)注多種成分的特點(diǎn),比傳統(tǒng)單一成分測(cè)定法所得信息更多,更容易尋找到樣品之間化學(xué)成分群的微小差異,從而實(shí)現(xiàn)藥材的區(qū)分鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)[5]。HPLC法具有操作簡便、分析速度快、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),是目前的中藥材指紋圖譜分析最常使用的方法,采用該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜目前已廣泛應(yīng)用多種中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制[6-7]。目前已有冬蟲夏草HPLC指紋相關(guān)研究多關(guān)注冬蟲夏草與其他蟲草屬真菌的真?zhèn)舞b別[8-11],較少開展冬蟲夏草與其發(fā)酵菌絲體系統(tǒng)比較。

本實(shí)驗(yàn)擬選取19批次冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體,建立冬蟲夏草水溶性成分HPLC特征指紋,利用相似度評(píng)價(jià)法和化學(xué)模式識(shí)別法對(duì)冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),為冬蟲夏草質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬蟲夏草樣品 采集自青藏高原典型產(chǎn)區(qū),經(jīng)中山大學(xué)青藏高原研究團(tuán)隊(duì)劉昕教授、張古忍教授鑒定為冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體;冬蟲夏草無性型中國被毛孢(Hirsutellasinensis)菌株C-YS和C-LZ 分離自青海玉樹和西藏林芝自然環(huán)境生長的新鮮冬蟲夏草,菌株保藏在中山大學(xué)食品與健康工程研究院;冬蟲夏草菌絲體工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品“百令膠囊” 杭州中美華東制藥有限公司,批號(hào)140503,購自廣州市藥店，樣品詳細(xì)信息見表1;腺苷、肌苷、胞苷、尿苷、鳥苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤、蟲草素對(duì)照品 均購于Sigma-Aldrich公司(純度均≥98%,批號(hào)分別為WXBB2139V,016K0037,C122106-1G,SLBD9919V,SLBC0093V,T0376-5G,074K0619,M4030V);甲醇 色譜級(jí),德國Merck公司;實(shí)驗(yàn)用水 為經(jīng)Millipore Simplicity system處理后的超純水;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉 英國OXOID公司;葡萄糖、蔗糖 廣州化學(xué)試劑廠;馬鈴薯 廣州百佳超市;其他試劑 均為分析純。

表1 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體樣品來源Table 1 Origins of the O. sinensis and fermentation mycelium

高效液相色譜系統(tǒng)(1525二元泵-2996光電二極管陣列檢測(cè)器(Photodiode Array Detector,PDA)) 美國Waters公司;Simplicity型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;5415R型冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;DK-8D型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;SB-3200型超聲波清洗器 上海新芝生物技術(shù)研究所;BP211D型密電子分析天平 德國Sartorius公司;QL-901型渦旋振蕩儀 江蘇海門其林貝爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冬蟲夏草菌絲體制備 取適量保存菌種接種到固體種子培養(yǎng)基(馬鈴薯300 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物1 g/L,瓊脂粉15 g/L),于18 ℃培養(yǎng)30 d后,接種到液體培養(yǎng)基中(馬鈴薯300 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物1 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4(7H2O 0.5 g/L),120 r/min,18 ℃培養(yǎng)20 d即為液體種子。吸取5 mL液體種子接種到培養(yǎng)基(蔗糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物3 g/L),120 r/min,18 ℃培養(yǎng)40 d。發(fā)酵結(jié)束后,使用低壓抽濾法收集菌絲體。菌絲體用超純水清洗3次以上,再經(jīng)冷凍干燥后,研磨成細(xì)粉密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為甲醇(A)-0.3%乙酸溶液(B),梯度洗脫(0～10 min,0% B;10～20 min,0%～8% B,20～30 min,8%～20% B;30～40 min,20% B),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量20 μL,柱溫25 ℃,檢測(cè)波長260 nm。

1.2.3 對(duì)照品溶液制備和線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品腺苷、肌苷、胞苷、尿苷、鳥苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤、蟲草素各15 mg,加入適量去離子水溶解樣品,定容至25 mL,配成濃度分別為100、75、50、25、10、5、1、0.5 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液,過0.45 μm濾膜后,按照1.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行HPLC測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次。以色譜峰積分面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.4 供試品溶液制備 稱量已研磨成細(xì)粉的冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體樣品0.25 g,加入超純水10 mL,稱量總質(zhì)量,于50 ℃,30 kHz超聲提取40 min,放置至室溫,用水補(bǔ)足損失重量,混勻,過0.45 μm濾膜,即得。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S4號(hào)冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照1.2.2項(xiàng)下的方法連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄HPLC指紋圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。

1.2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S4號(hào)冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0、2、6、12、18、24 h后按照1.2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢測(cè),記錄HPLC指紋圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。

1.2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S4號(hào)冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行6次試驗(yàn),按照1.2.2項(xiàng)下的方法分別進(jìn)樣記錄每份樣品的HPLC指紋圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。

1.2.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量的冬蟲夏草供試品(S4號(hào))6份,加入超純水9 mL,再加入200 μg/mL混合對(duì)照品溶液1 mL,按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試液,按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用中藥《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)進(jìn)行冬蟲夏草指紋圖譜相似度計(jì)算。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和t檢驗(yàn),采用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

根據(jù)不同濃度混合對(duì)照品色譜峰積分面積計(jì)算得到胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的線性回歸方程分別為y=38761x+2403,y=44565x+3085,y=32631x+2924,y=52077x+1884.6和y=88285x+5120,各待測(cè)成分的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999,表明在濃度為0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)曲線線性關(guān)系良好。

2.2 方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)所得圖譜相似度均大于0.999,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.21%～1.00%,相對(duì)峰面積RSD為0.87%～2.99%;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得圖譜相似度均大于0.999,各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.38%～0.97%,相對(duì)峰面積RSD為0.99%～3.04%;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)所得圖譜相似度均大于0.995,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.29%～1.05%,相對(duì)峰面積RSD為1%～3.16%;加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的加樣回收率分別為101.48%±2.89%,103.36%±1.43%,103.96%±2.45%,107.23%±2.92%和104.67%±2.38%,RSD分別為2.84%,1.38%,2.36%,2.72%和2.27%。結(jié)果表明儀器的精密度良好,方法重現(xiàn)性較高,供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定,符合指紋圖譜的要求。

2.3 冬蟲夏草HPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.3.1 指紋圖譜建立與共有峰標(biāo)定 取10批冬蟲夏草樣品,按照1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按照1.2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢驗(yàn),記錄其色譜圖,導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版),樣品匹配色譜圖見圖1。以S4號(hào)樣品的HPLC圖譜作為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法生成冬蟲夏草對(duì)照指紋圖譜,共獲得18個(gè)共有峰,并指定出其中5個(gè)共有峰,分別為胞苷(5號(hào)峰),尿苷(9號(hào)峰),肌苷(12號(hào)峰),鳥苷(13號(hào)峰)和腺苷(14號(hào)峰),見圖2。每批樣品共有峰面積均占總色譜峰面積的90%以上,滿足指紋圖譜分析要求。以分離度較好、峰面積較大且保留時(shí)間適中的9號(hào)峰為參照峰,分別計(jì)算10批冬蟲夏草共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果顯示各批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.424%～5.572%,相對(duì)峰面積RSD為18.858%～116.12%,見表2、表3。

圖1 10批冬蟲夏草樣品的HPLC指紋譜Fig.1 HPLC fingerprints of 10 batches of O. sinensis

圖2 冬蟲夏草HPLC 對(duì)照指紋譜Fig.2 Common mode of HPLC fingerprints of O. sinensis注:5.胞苷;9.尿苷(參照峰);12.肌苷;13.鳥苷;14.腺苷。

表2 10批冬蟲夏草HPLC指紋圖譜中共有峰相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks in 10 batches of O. sinensis

表3 10批冬蟲夏草 HPLC 指紋圖譜中共有峰相對(duì)保留時(shí)間Table 3 Relative retention time of common peaks in 10 batches of O. sinensis

2.3.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 取9批不同來源的冬蟲夏草菌絲體樣品,按照1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按照1.2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢驗(yàn),記錄樣品色譜圖,導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A 版),以冬蟲夏草對(duì)照指紋為參照譜進(jìn)行多點(diǎn)校正,匹配后共獲得9個(gè)共有峰,共指認(rèn)出其中5個(gè)共有峰,分別為胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷,圖3為匹配后色譜圖。9批冬蟲夏草菌絲體中主要色譜峰為尿苷、鳥苷和腺苷,而冬蟲夏草中含量較高的肌苷微量存在于菌絲體中,表明肌苷可能是冬蟲夏草區(qū)別于菌絲體的特征性成分。以4號(hào)峰為參照峰計(jì)算得到9批冬蟲夏草菌絲體共有指紋峰相對(duì)峰面積RSD為26.162%～65.246%,見表4。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算19批冬蟲夏草及其菌絲體的相似度,結(jié)果見表5。與對(duì)照指紋圖譜相比,10批冬蟲夏草的相似度為0.964～0.993,而9批冬蟲夏草菌絲體的相似度為0.563～0.693,表明冬蟲夏草菌絲體與冬蟲夏草水溶性成分存在較大差異,根據(jù)指紋圖譜特征可進(jìn)行有效區(qū)分。

表4 9批冬蟲夏草菌絲體 HPLC 指紋圖譜中共有峰相對(duì)峰面積Table 4 Relative peak area of common peaks in 9 batches of cultivated mycelium

表5 冬蟲夏草及冬蟲夏草菌絲體樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Similarities of fingerprints of 19 batches O. sinensis and cultivated mycelium

圖3 9批冬蟲夏草菌絲體的HPLC指紋譜Fig.3 HPLC fingerprints of 9 batches of cultivated mycelium注:2.胞苷;4.尿苷(參照峰);5.肌苷;6.鳥苷;7.腺苷。

2.3.3 含量測(cè)定結(jié)果 按照外標(biāo)法計(jì)算19批樣品中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量,結(jié)果見表6。將所有樣品分為冬蟲夏草和菌絲體兩個(gè)組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果顯示冬蟲夏草中肌苷和尿苷含量顯著高于冬蟲夏草菌絲體,腺苷含量顯著低于冬蟲夏草菌絲體,胞苷和鳥苷含量在兩組樣品之間無顯著差異。

表6 19批冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)Table 6 Determination results of cytidine,uridine,inosine,guanosine and adenosine in 19 batches of samples(mg/g)

2.4 模式識(shí)別分析

2.4.1 主成分分析 利用SIMCA-P 13.0軟件,以冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體色譜圖中的18個(gè)共有峰積分面積為變量對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析。前3個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率分別為56.6%,26.6%和7.53%,累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.7%,因此提取前3個(gè)主成分對(duì)樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見圖4。冬蟲夏草與冬蟲夏草菌絲體在主成分得分圖上分為3類,冬蟲夏草單獨(dú)為1類(S1～S10),S11～S16號(hào)冬蟲夏草菌絲體為1類,S17～S19號(hào)發(fā)酵產(chǎn)品百令膠囊為1類。

圖4 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體主成分得分圖Fig.4 PCA score scatter plot of O. sinensis and cultivated mycelium

2.4.2 聚類分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件,以冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體色譜圖中的18個(gè)共有峰積分面積為變量,進(jìn)行Z得分標(biāo)準(zhǔn)化處理后,采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法,以歐氏距離為樣品親疏關(guān)系度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖5。當(dāng)距離為16時(shí),所有樣品分為3類,其中冬蟲夏草為1類(S1～S10),實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體為1類(S11～S16),工業(yè)發(fā)酵菌絲體產(chǎn)品為1類(S17～S19)。聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致,能夠?qū)崿F(xiàn)基于指紋特征的樣品分類。

圖5 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體聚類分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis of O. sinensis and cultivated mycelium

3 結(jié)論

本研究采用HPLC指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)不同來源冬蟲夏草進(jìn)行分析,對(duì)19批冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),從化學(xué)層面揭示了冬蟲夏草與其發(fā)酵菌絲體之間的內(nèi)在品質(zhì)差異,為冬蟲夏草質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種有效方法。不同產(chǎn)地批次冬蟲夏草指紋一致性較高,表明所含化學(xué)成分基本相同;冬蟲夏草與冬蟲夏草菌絲體指紋相似度較低,共有成分中肌苷、腺苷和尿苷含量差異顯著,它們可能是導(dǎo)致兩組樣品區(qū)分的重要特征成分。本研究只對(duì)冬蟲夏草水溶性指紋中核苷類成分進(jìn)行了指認(rèn),而提取物中其他化合物的表征和其對(duì)冬蟲夏草質(zhì)量的影響,有待進(jìn)一步研究探討。