枯草芽孢桿菌M364高產(chǎn)抗菌肽Bacillomycin D工業(yè)培養(yǎng)基優(yōu)化

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(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是在自然界中廣泛存在的一類嗜溫、好氧且產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌,已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)界定為“GRAS”(generally recognized as safe)[1-2]。枯草芽孢桿菌合成、分泌的抗菌物質(zhì)是具有表面活性的一類抗菌脂肽(antimicrobial peptides,AMPs),如Surfactin家族、Iturin家族和Fengycin家族[3-6]。抗菌肽Bacillomycin D是由枯草芽孢桿菌非核糖體酶催化合成的一種屬于Iturin家族的抗菌脂肽,它是由一個(gè)親水性環(huán)狀七肽和一個(gè)疏水性β-氨基脂肪鏈相連而成的，具有表面活性的雙親性環(huán)狀脂肽[7]。Bacillomycin D的理化性質(zhì)穩(wěn)定,121 ℃、30 min保持95%抗菌活性,pH7.6活性最強(qiáng),且對(duì)蛋白酶類不敏感;25 W紫外燈下,距離約5 cm,照射8 h不影響活性,這與Iturins家族的理化特性一致[8-9]。Bacillomycin D是抑制黃曲霉最強(qiáng)的一種脂肽抗生素,并具有與其它脂肽類抗生素?zé)o交叉耐藥性、安全無毒、抗菌譜廣、易被生物降解等優(yōu)點(diǎn)[10-11],因此Bacillomycin D在食品或糧食防腐方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

長(zhǎng)期以來,抗菌肽的發(fā)酵水平和生產(chǎn)效率偏低以及較高的生產(chǎn)成本，制約著其開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)。目前Bacillomycin D的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基以葡萄糖[12]、酵母膏[12-13]和谷氨酸鈉[14]為主要碳、氮源,發(fā)酵過程中需要補(bǔ)料和控制pH,過程復(fù)雜且能耗高,這并不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。一些研究利用菊糖[15]或L-谷氨酰胺[16]通過代謝調(diào)控可提高Bacillomycin D產(chǎn)量,或者通過傳統(tǒng)誘變[13]或基因組改組[17]篩選高產(chǎn)Bacillomycin D菌株均是使用現(xiàn)有的培養(yǎng)基,沒有對(duì)培養(yǎng)基成本進(jìn)行考慮,成本較高。我國是農(nóng)業(yè)大國,而玉米漿是在玉米淀粉的制作過程中的副產(chǎn)物,其制作原料易得并且價(jià)格低廉,如果能以玉米淀粉加工副產(chǎn)物代替葡萄糖或谷氨酸鈉,不但可以提高副產(chǎn)品的利用率,還能在提高Bacillomycin D產(chǎn)量的同時(shí)降低其生產(chǎn)成本。因此,通過培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化,尋找能夠降低生產(chǎn)成本、提高抗菌肽產(chǎn)量的方法具有重要的研究意義。

本研究主要是對(duì)誘變菌M364發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽Bacillomycin D的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。以一種Bacillomycin D產(chǎn)量略高于常用的Landy(240 mg/L)配方的廉價(jià)培養(yǎng)基6010為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,先后利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、Central Composite Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌M364發(fā)酵生產(chǎn)Bacillomycin D的培養(yǎng)基6010進(jìn)行優(yōu)化,并通過19 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證,旨在提高抗菌肽Bacillomycin D的產(chǎn)量為后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌M364 由枯草芽孢桿菌BacillussubtilisfmbJ(CGMCC NO.0943)通過亞硝酸胍誘變得到的突變菌株;乙腈、三氟乙酸、甲醇 色譜純,Tedia公司;其它試劑 分析純,國藥集團(tuán);斜面培養(yǎng)基NB(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH7.0～7.2；種子培養(yǎng)基 不添加瓊脂,其余組分同斜面培養(yǎng)基NB；初始發(fā)酵培養(yǎng)基Landy(g/L) 酵母膏1.0,谷氨酸鈉5,KCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,L-苯丙氨酸0.02,CuSO4·5H2O 0.0016,FeSO40.0015,KH2PO41.0,葡萄糖20,pH7.0;6010培養(yǎng)基(g/L) 麥芽糖漿50,葡萄糖20,玉米漿20,尿素3,(NH4)2SO46,K2HPO46,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.03,pH7.0。

TOMY SX-700高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司;L1523 19L-原位滅菌發(fā)酵罐 瑞士比歐生物工程公司;全溫?fù)u瓶柜 江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Ultimate3000高效液相分析系統(tǒng) 美國賽默飛公司;高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Bacillomycin D的發(fā)酵生產(chǎn) 將B.subtilisM364在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線,于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行過夜活化16 h,挑取單菌落,接入種子培養(yǎng)基,于37 ℃,180 r/min培養(yǎng)12 h。將種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h。搖瓶發(fā)酵均在250 mL三角瓶進(jìn)行,發(fā)酵溫度為33 ℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.2 Bacillomycin D的提取 取發(fā)酵液,8000 r/min常溫離心10 min,得上清液。用2 moL/L HCl將上清液pH調(diào)至2.0,4 ℃靜置12 h,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,棄上清得沉淀,向沉淀中加入純甲醇進(jìn)行萃取,用4 moL/L NaOH將萃取液pH調(diào)至7.0,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,棄沉淀得上清,即為Bacillomycin D粗品。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以原始6010培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵條件如1.2.1所述,發(fā)酵結(jié)束后HPLC法測(cè)Bacillomycin D產(chǎn)量,考察不同成分添加量的范圍,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其中,麥芽糖漿添加量為30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 g/L;葡萄糖添加量為0、10.0、20.0、30.0、40.0 g/L;玉米漿添加量為10.0、20.0、30.0、40.0 mL/L;尿素添加量為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L;(NH4)2SO4添加量為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L;K2HPO4添加量為4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L;MgSO4·7H2O添加量為0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 g/L;MnSO4·H2O添加量為0.01、0.03、0.06、0.09、0.12 g/L。當(dāng)變化其中一個(gè)因素的添加水平時(shí),其余7個(gè)因素固定為基礎(chǔ)培養(yǎng)基6010原始添加水平。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)功能,使用Plackett-Burman法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),可以用相對(duì)較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)判斷出較多因素對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響的重要性,并初步估計(jì)合適的添加量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用n=11的Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基6010的7個(gè)組分:麥芽糖漿、玉米漿、尿素、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O的重要性進(jìn)行考察,篩選出對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響顯著的關(guān)鍵因素,具體因素水平如表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels for the Plackett-Burman design

1.2.5 中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design) 響應(yīng)面優(yōu)化法與傳統(tǒng)的正交優(yōu)化法相比,更適合多變量復(fù)雜體系的優(yōu)化分析,而且可充分考慮因素間交互作用對(duì)響應(yīng)變量的影響[18]。中心組合設(shè)計(jì)是通過構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)數(shù)值模型并經(jīng)回歸分析和方差分析,可用于尋找最優(yōu)參數(shù)組合和評(píng)價(jià)復(fù)雜體系中各因素的影響重要性,適用于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基優(yōu)化[19]。由于PB試驗(yàn)結(jié)果顯示尿素對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量是負(fù)影響,且影響較大,所以為縮小尿素范圍,選擇0.76 g/L為尿素響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)的中心點(diǎn)。結(jié)合1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果與中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素5水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)方案,其中14個(gè)點(diǎn)是析因點(diǎn),剩余6個(gè)點(diǎn)為中心復(fù)合點(diǎn),各試驗(yàn)因素水平如表2。

表2 中心組合設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 The factors and levels for the Central Composite Design

1.2.6 優(yōu)化后培養(yǎng)基-19 L發(fā)酵罐驗(yàn)證 發(fā)酵培養(yǎng)基采用1.2.5優(yōu)化后培養(yǎng)基,裝液系數(shù)0.52,將種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種至19 L發(fā)酵罐,通氣量為1.5 vvm,轉(zhuǎn)速為500 r/min,pH自然。0～4 h培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度為35 ℃,4～7 h逐漸降至33 ℃,培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液溶氧量(DO%)和pH分別由發(fā)酵罐自帶的溶氧電極和pH電極直接測(cè)得。前期每2 h取1次樣,在波長(zhǎng)600 nm下檢測(cè)發(fā)酵液OD值,并用HPLC檢測(cè)Bacillomycin D產(chǎn)量,以確定Bacillomycin D產(chǎn)量最高點(diǎn)及最佳放罐時(shí)間。

1.2.7 Bacillomycin D含量檢測(cè) 采用RP-C18柱進(jìn)行高效液相色譜分析Bacillomycin D產(chǎn)量[7]。以A:乙腈+0.1%三氟乙酸,B:水+0.1%三氟乙酸,為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。0～15 min內(nèi),A相由30%線性增加為45%,B相由70%線性減少到55%;15～35 min,A相由45%增加為55%,B相由55%減少到45%。進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;流速:0.6 mL/min;Bacillomycin D的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=7.6396x-2.3576,x:峰面積;y:Bacillomycin D濃度(mg/L),R2=0.9999。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算,以及作圖。響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析使用Design-Expert.v 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 麥芽糖漿添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖1所示,隨著麥芽糖漿添加量的增加,Bacillomycin D產(chǎn)量增加,當(dāng)添加量為50 g/L時(shí),產(chǎn)量最高;當(dāng)麥芽糖漿添加量大于50 g/L時(shí),Bacillomycin D的產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)辂溠刻菨{是6010培養(yǎng)基中的主要碳源,它可被麥芽糖酶水解成2個(gè)葡萄糖分子,能夠有效地為菌體生長(zhǎng)、代謝提供所需的能量。但麥芽糖漿添加量過高時(shí),分解代謝形成的葡萄糖含量過高，不僅造成培養(yǎng)基碳氮比失衡，而且糖含量太高也會(huì)使得發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH過低，影響菌體的活性,進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。因此,初步確定麥芽糖漿添加量為50.0 g/L效果最好。

圖1 麥芽糖漿添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of maltose syrup addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.2 葡萄糖添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖2所示,Bacillomycin D產(chǎn)量隨著葡萄糖添加量的增加呈下降趨勢(shì),且不添加葡萄糖時(shí)產(chǎn)量最高。這是因?yàn)锽acillomycin D是枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)到穩(wěn)定后期產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,葡萄糖屬于速效碳源,主要在菌體生長(zhǎng)初期被利用,而麥芽糖漿水解成葡萄糖分子為菌體后期代謝提供足夠的能量。所以額外添加葡萄糖造成培養(yǎng)基pH過低,以及葡萄糖阻遏效應(yīng)的發(fā)生，影響菌體生長(zhǎng)、代謝,這與闞欣等[20]和李紅等[21]研究結(jié)果一致,因此剔除葡萄糖。

圖2 葡萄糖添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glucose addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.3 玉米漿添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖3所示,隨著玉米漿添加量增加,Bacillomycin D產(chǎn)量增加,當(dāng)其添加量為20 mL/L時(shí)產(chǎn)量最高;當(dāng)玉米漿添加量大于20 mL/L時(shí),Bacillomycin D產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。因?yàn)橛衩诐{含有豐富的氨基酸、核酸和一些前體物質(zhì)等,其中生物素作為菌體細(xì)胞膜合成的必要元素,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性,同時(shí)也是羧化酶系等關(guān)鍵酶的輔酶,對(duì)細(xì)胞中心代謝具有重要的調(diào)控作用[22],所以有機(jī)氮源玉米漿是提供細(xì)胞生長(zhǎng)的的主要物質(zhì)。在玉米漿添加量較低時(shí),菌體生長(zhǎng)很微弱,Bacillomycin D產(chǎn)量較低,但含量過高時(shí),會(huì)造成培養(yǎng)基碳氮比失衡，同樣不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝[23]。因此,初步確定玉米漿添加量為20.0 mL/L時(shí)效果最好。

圖3 玉米漿添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of corn steep liquor addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.4 尿素添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖4所示,Bacillomycin D產(chǎn)量隨著尿素添加量的增加,呈快速增加趨勢(shì),當(dāng)添加量大于1.0 g/L時(shí),Bacillomycin D產(chǎn)量逐漸下降。由于6010培養(yǎng)基中含有多種氮源,不添加尿素時(shí)Bacillomycin D產(chǎn)量依然達(dá)到420 mg/L,但達(dá)不到尿素和其它氮源混合使用時(shí)的效果;當(dāng)尿素添加量過高時(shí),導(dǎo)致培養(yǎng)基碳氮比降低,發(fā)酵培養(yǎng)基pH過高,菌體活性受到抑制且不利于產(chǎn)物的積累。因此,初步確定尿素添加量為1.0 g/L時(shí)效果最好。

圖4 尿素添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of urea addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.5 (NH4)2SO4添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖5所示,隨著(NH4)2SO4添加量增加,Bacillomycin D產(chǎn)量呈升高后降低趨勢(shì),當(dāng)(NH4)2SO4添加量為4.0 g/L時(shí)Bacillomycin D產(chǎn)量最高,但(NH4)2SO4添加量的變化對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響并不明顯。在菌體生長(zhǎng)初期,玉米漿中的多肽、蛋白類物質(zhì)沒有降解,無法提供有機(jī)氮源時(shí),(NH4)2SO4作為速效氮源,其銨根離子可以為菌體提供無機(jī)氮源,以便菌體的快速增殖,此外(NH4)2SO4的加入有助于降低尿素對(duì)培養(yǎng)基pH帶來的影響。但過量的(NH4)2SO4會(huì)降低培養(yǎng)基碳氮比,不利于菌體的生長(zhǎng)代謝。因此,初步確定(NH4)2SO4添加量為4.0 g/L時(shí)效果最好。

圖5 (NH4)2SO4添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of(NH4)2SO4 addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.6 K2HPO4添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖6所示,Bacillomycin D產(chǎn)量隨著K2HPO4添加量的增加呈遞增趨勢(shì),當(dāng)添加量為8.0 g/L時(shí)產(chǎn)量最高,之后再增加K2HPO4添加量，Bacillomycin D產(chǎn)量逐漸降低。磷酸鹽在微生物發(fā)酵過程中不僅可以維持培養(yǎng)基pH穩(wěn)定,而且是菌體核酸合成代謝所必需的元素[24],同時(shí)氨基酸前體的活化及一些與代謝有關(guān)的酶的合成都與磷酸根有關(guān),其添加量的高與低都會(huì)抑制抗菌肽產(chǎn)量[25]。因此,初步確定K2HPO4添加量為8.00 g/L時(shí)效果最好。

圖6 K2HPO4添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of K2HPO4 addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.7 MgSO4·7H2O添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖7所示,MgSO4·7H2O添加量在0.05～0.30 g/L時(shí),Bacillomycin D產(chǎn)量隨著Mg2+添加量的增加而增加;當(dāng)Mg2+添加量達(dá)到0.30 g/L時(shí),Bacillomycin D產(chǎn)量最高,此時(shí)再增加Mg2+添加量,Bacillomycin D產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)镸g2+是許多重要酶的激活劑,一般認(rèn)為Mg2+與磷酸功能團(tuán)生成鰲合結(jié)構(gòu),形成一種在轉(zhuǎn)移反應(yīng)中達(dá)到最大活性的構(gòu)型。而能量轉(zhuǎn)移的基本過程發(fā)生于糖酵解、三羧酸循環(huán)和呼吸過程(如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等)中,所以Mg2+在糖酵解和三羧酸循環(huán)等幾乎所有磷酸化過程的酶促反應(yīng)中起輔助因素作用,因此合適的Mg2+添加量促進(jìn)Bacillomycin D的產(chǎn)生,然而添加過量的Mg2+會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[26-27]。因此,初步確定MgSO4·7H2O添加量為0.30 g/L時(shí)效果最好。

圖7 MgSO4·7H2O添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of MgSO4·7H2O addition on the yield of Bacillomycin D

注:*:差異顯著(p<0.05),**:差異極顯著(p<0.01),表6同。2.1.8 MnSO4·H2O添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響 如圖8所示,Bacillomycin D產(chǎn)量隨著MnSO4·H2O添加量的增加而增加,當(dāng)MnSO4·H2O添加量為0.06 g/L時(shí)抗菌肽產(chǎn)量最高,MnSO4·H2O添加量再增加,Bacillomycin D產(chǎn)量逐漸降低。Mn2+是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶所需要的離子,其存在可加速菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶量進(jìn)而促進(jìn)Bacillomycin D產(chǎn)量的增加,但Mn2+過高時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,影響菌體活性。因此,初步確定MnSO4·H2O添加量為0.06 g/L時(shí)效果最好。

圖8 MnSO4·H2O添加量對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of MnSO4·H2O addition on the yield of Bacillomycin D

2.2 Plackett-Burman Design(PB)試驗(yàn)結(jié)果

PB實(shí)驗(yàn)是通過對(duì)每個(gè)因子取兩水平來分析,通過比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表4所示,該模型具有較高顯著性(p模型=0.0041<0.01),擬合度較好(R2=97.67%)。盡管PB實(shí)驗(yàn)顯示因素D對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響極顯著(p<0.01),但單因素實(shí)驗(yàn)證實(shí)(NH4)2SO4添加量變化對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量無明顯影響,因此，根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響力的大小及顯著性,選取尿素(p=0.0011)、麥芽糖漿(p=0.0053)、MgSO4·7H2O(p=0.0047)進(jìn)一步優(yōu)化。其他因子正效應(yīng)取(+1)水平,負(fù)效應(yīng)取(-1)水平。

表4 PB試驗(yàn)各因素對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響的方差分析Table 4 Analysis of variance for influence of variable on Bacillomycin D yield in the Plackett-Burman design

2.3 CCD試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 通過對(duì)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,以Bacillomycin D產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,麥芽糖漿(X1)、尿素(X2)、MgSO4·7H2O(X3)添加量為變量,其它培養(yǎng)基組分維持恒定進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果如表5所示。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸模擬,得到模型的二次回歸方程:

表6 中心組合設(shè)計(jì)的方差分析Table 6 ANOVA of the central composite design

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析 響應(yīng)曲面是在所考察的三個(gè)因素中的任意兩個(gè)因素水平固定的前提下,以中心組合設(shè)計(jì)中的響應(yīng)值為縱坐標(biāo),其他因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標(biāo)所構(gòu)成的三維模型[28]。

從圖9可以看出,等高線為橢圓形,表明MgSO4·7H2O添加量一定時(shí),麥芽糖漿和尿素之間存在交互作用。當(dāng)尿素添加量保持不變,麥芽糖漿添加量低于46.0 g/L時(shí),隨著麥芽糖漿添加量增加,Bacillomycin D產(chǎn)量增加。當(dāng)麥芽糖漿添加量高于46.00 g/L時(shí),隨著麥芽糖漿添加量增加,Bacillomycin D產(chǎn)量減少,并且在不同的尿素添加量下,變化幅度存在差別。麥芽糖漿增加到一定添加量時(shí),培養(yǎng)基中的氧的供給就會(huì)受到限制,而且過高的含糖量會(huì)造成細(xì)胞的無氧呼吸,發(fā)酵液pH過低都會(huì)影響到菌體的活性。保持麥芽糖漿添加量不變時(shí),隨著尿素添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產(chǎn)量增加,當(dāng)尿素添加量超過0.72 g/L時(shí),Bacillomycin D產(chǎn)量逐漸降低。由于培養(yǎng)基中含有多種氮源,適當(dāng)?shù)哪蛩靥砑恿靠梢蕴岣呖咕漠a(chǎn)量,過多的尿素會(huì)造成碳氮比失衡,導(dǎo)致Bacillomycin D產(chǎn)量下降。

圖9 麥芽糖漿與尿素對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of maltose syrup and urea on the Bacillomycin D production

圖10顯示等高線為橢圓形,這表明尿素添加量一定時(shí),麥芽糖漿和MgSO4·7H2O之間存在交互作用。無論MgSO4·7H2O處于何種水平,隨著麥芽糖漿添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產(chǎn)量呈先增加后降低的趨勢(shì),過量的麥芽糖漿會(huì)造成培養(yǎng)基碳氮比失衡,培養(yǎng)基pH過低,抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),降低細(xì)胞中酶的活性。當(dāng)麥芽糖漿處于低水平時(shí),隨著MgSO4·7H2O添加量的變化,雖然Bacillomycin D產(chǎn)量也是呈先增加后降低的趨勢(shì),但變化幅度并不明顯,原因可能是此時(shí)Mg2+對(duì)酶的影響不是主要限制因素,麥芽糖漿所能提供的能量是限制Bacillomycin D產(chǎn)量的主要影響因素。這也與方差分析顯示的麥芽糖漿對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量影響程度要大于MgSO4·7H2O帶來的影響所吻合。

圖10 麥芽糖漿與MgSO4·7H2O對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of maltose syrup and MgSO4·7H2O on the Bacillomycin D production

圖11顯示等高線為橢圓形,表明麥芽糖漿添加量一定時(shí),尿素和MgSO4·7H2O之間存在交互作用且交互作用顯著(p<0.05)。無論MgSO4·7H2O處于什么水平,隨著尿素添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產(chǎn)量先升高后降低。尿素添加量過低時(shí)，不足以提供發(fā)酵過程中所需氮源,且與其它種類氮源無法起到復(fù)配效果[29],而尿素添加量過高時(shí)，又造成培養(yǎng)基碳氮比失衡和培養(yǎng)基pH過高，同樣影響B(tài)acillomycin D產(chǎn)量。無論尿素添加量處于什么水平時(shí),隨著MgSO4·7H2O添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產(chǎn)量先升高后降低。Mg2+不僅是許多重要酶的激活劑,而且有研究表明,Mg2+也可能是作用于某些生物合成途徑,調(diào)節(jié)與抗生素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來影響次級(jí)代謝[30]。因此Mg2+與麥芽糖漿、尿素都有一定的交互作用,且與尿素的交互作用顯著(p<0.05)。

圖11 尿素與MgSO4·7H2O對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of urea and MgSO4·7H2O on the Bacillomycin D production

2.4 最佳培養(yǎng)基的確定及驗(yàn)證

根據(jù)模型得到的最佳工業(yè)培養(yǎng)基為:麥芽糖漿46 g/L,尿素0.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L,玉米漿16 g/L,(NH4)2SO43 g/L,K2HPO47 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L,在此條件下預(yù)測(cè)的最大產(chǎn)量為596.89 mg/L。以此培養(yǎng)基進(jìn)行33 ℃,180 r/min發(fā)酵72 h,最終Bacillomycin D產(chǎn)量達(dá)到(620.2±13.9) mg/L,與預(yù)測(cè)值較為接近,說明優(yōu)化模型穩(wěn)定可靠。

2.5 19 L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)結(jié)果

搖瓶研究初始培養(yǎng)溫度和接種量分別為33 ℃和5%,為減少菌體由種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中溫度帶來的影響,將初始培養(yǎng)溫度提高到35 ℃,再緩慢降溫到33 ℃培養(yǎng)。而且發(fā)酵罐擁有更大的培養(yǎng)空間以及更好的溶氧環(huán)境,為使菌體快速增長(zhǎng),將接種量提高到10%。圖12可以看出,菌體在4 h時(shí)便迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。發(fā)酵罐更高的通氣量和轉(zhuǎn)速,保證了菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期快速增長(zhǎng)時(shí)對(duì)溶氧的需求,使得菌體在16 h時(shí)便達(dá)到穩(wěn)定期,32 h后菌體進(jìn)入衰亡期。高效液相檢測(cè)36 h時(shí)Bacillomycin D產(chǎn)量已達(dá)到最高值(890.6±20.1) mg/L,再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間Bacillomycin D產(chǎn)量不增加且呈下降趨勢(shì),所以選擇36 h放罐最為經(jīng)濟(jì)。優(yōu)化后的6010培養(yǎng)基,在發(fā)酵罐中Bacillomycin D產(chǎn)量相比搖瓶提高了44%,較原始6010培養(yǎng)基提高了1.14倍,且發(fā)酵時(shí)間相比搖瓶發(fā)酵縮短了36 h,這說明發(fā)酵罐更好的溶氧條件對(duì)菌體次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝和積累具有促進(jìn)作用。

圖12 19 L發(fā)酵罐OD600/DO%/pH檢測(cè)Fig.12 19 L fermenter OD600/DO%/pH detection

3 結(jié)論

麥芽糖漿和玉米漿可以很好的代替葡萄糖和谷氨酸鈉來生產(chǎn)抗菌肽Bacillomycin D,以這些廉價(jià)原料為主要的碳氮源的工業(yè)化培養(yǎng)基,可以有效的降低發(fā)酵成本。通過Plackett-Burman design實(shí)驗(yàn)篩選出影響B(tài)acillomycin D產(chǎn)量的關(guān)鍵因素,然后采用響應(yīng)面法確定最佳工業(yè)培養(yǎng)基配方為:麥芽糖漿46 g/L,尿素0.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L,玉米漿16 mL/L,(NH4)2SO43 g/L,K2HPO47 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。在此條件下枯草芽孢桿菌M364發(fā)酵抗菌肽Bacillomycin D產(chǎn)量可以達(dá)到(620.2±13.9) mg/L,并且在19 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到(890.6±20.1) mg/L,相比搖瓶產(chǎn)量提高了44%,較原始6010培養(yǎng)基提高了1.14倍,同時(shí)發(fā)酵時(shí)間縮短了36 h。因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的6010培養(yǎng)基,不僅培養(yǎng)基組分廉價(jià),而且在降低發(fā)酵成本的同時(shí)提高了抗菌肽產(chǎn)量,并有效的縮短發(fā)酵時(shí)間,為抗菌肽Bacillomycin D工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。