米根霉和乳酸菌混合固態發酵大麥仁工藝優化及其抗氧化活性

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(黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319)

大麥營養豐富,除蛋白質含量較高外,還有豐富的膳食纖維、維生素及礦物質元素。其營養成分總指標符合現代營養學所提出的高纖維、高維生素、高植物蛋白、低糖及低油脂的“三高兩低”新型功能食品的要求[1-2]。此外,大麥還能改善消化不良、促進腸道蠕動、減輕便秘,尤其適合中老年人食用[3]。然而,正是由于大麥富含纖維素和蛋白質,所以無論是加工制粉或是其他產品,都存在一定的適口性問題,這也是制約其發展的主要因素之一[4-5]。開發新型功能性大麥食品,不僅可以提高大麥的食品加工利用率,為大麥的綜合有效利用提供科學理論依據,還可為改善國民的健康狀況做出貢獻。近年來谷物發酵食品的逐漸風靡,為我們提供了一條開發功能性大麥食品的新途徑。

微生物發酵不僅可以賦予谷物新的風味和質地,還可以改善其生理活性。Feng等[6]利用少孢根霉和酵母菌對大麥進行固態發酵,發現發酵并不影響氨基酸的含量和成分,也不會降低肌醇六磷酸酯的含量,但是卻能夠增加維生素B6和煙酰胺的量。Xiao等[7]也發現經蛹蟲草發酵后的燕麥的抗氧化能力獲得明顯提升。乳酸菌因其公認的安全地位,其相應的發酵食品近年來更是備受關注。然而,乳酸菌的淀粉酶和蛋白酶活力相對較低,因此乳酸菌發酵食品多以液態發酵為主,如乳酸菌大麥飲料[8]。但液態發酵存在產率較低、產品運輸困難和投資成本高等多種問題,這嚴重阻礙了大麥的大規模利用。而固態發酵可以很好地解決這些問題。有研究表明利用微生物混合發酵法能夠有效促進乳酸菌在固態基質中的生長[9]。Feng等[10]研究表明在少孢根霉存在下,植物乳桿菌(L.plantarumSR3.60)、發酵乳桿菌(L.fermentumATCC 14931)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteriDSM 20016)和乳酸乳桿菌(L.lactisSR3.53)可以在固態大麥基質中良好生長。同時,在乳酸菌的作用下,大麥含有的多酚類物質可以由結合態轉化為游離態,從而使發酵產物的多酚含量明顯增加,進而增加其抗氧化活性[11]。因此,利用乳酸菌和霉菌混合固態發酵生產大麥發酵食品不僅具有理論可行性,還具有很好的開發前景。

米根霉作為傳統固態發酵的優勢菌種,其發達的淀粉和蛋白酶體系可以為乳酸菌的生長提供必需的小分子糖類和氨基酸。通過米根霉和乳酸菌混合發酵，既能賦予產品醇香和酸甜的風味,又可以達到增加乳酸菌的目的,從而進一步提升產品的功能特性。考慮到種皮的存在不利于微生物,尤其是乳酸菌的生長和發酵,本文采用大麥仁為原料,通過單因素實驗和正交試驗來確定米根霉和乳酸菌混合固態發酵大麥仁的最佳工藝,同時對產品的體外抗氧化活性進行分析,從而為大麥功能性食品的開發提供新的思路和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥仁 大慶市北京華聯超市;植物乳桿菌發酵劑 常州益菌加生物科技有限公司;米根霉(安琪甜酒曲) 安琪酵母股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;1,10-菲咯啉、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 合肥博美生物科技有限責任公司;H2O2、NaOH、沒食子酸、3,5-二硝基水楊酸等常規化學試劑 均為國產分析純。

FA1104A型分析天平 上海壘固儀器有限公司;TD5A型離心機 長沙英泰儀器有限公司;C21-SC821型電磁爐 九陽股份有限公司;722S型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;303A-2型電熱恒溫培養箱 菏澤市石油化工學校儀器設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大麥仁發酵工藝流程 大麥仁→清洗→浸泡→水煮→冷卻→接種→恒溫發酵→成品

操作要點:稱取適量大麥仁,清洗后添加適量自來水室溫浸泡。沸水蒸煮至熟透,待大麥仁瀝干放涼后,分別添加0.5%(w/w)的米根霉和0.15%(w/w)的植物乳桿菌干粉發酵劑,料水質量比為10∶1(瀝干大麥仁∶涼開水),最后置于30 ℃培養箱內恒溫發酵。

1.2.2 浸泡時間的確定 分別稱取21份20.0 g大麥仁,標記后倒入燒杯中。每個燒杯加入100 mL蒸餾水后室溫浸泡。每隔2 h取樣測定吸水率,觀察吸水膨脹狀態,確定最佳浸泡時間。

吸水率(%)=(A1-Ao)/Ao×100

式中,Ao為大麥仁初始質量;A1為浸泡后吸干表面水分的大麥仁質量。

1.2.3 蒸煮時間的確定 取清洗后大麥仁200 g,添加適量自來水后室溫浸泡8 h。浸泡結束后水煮,沸騰后每2 min檢驗一次。蒸煮時間選擇以麥仁熟透且有彈性,有麥香,內無白心為準。

1.2.4 單因素實驗 以總酸含量、還原糖含量以及感官得分為指標,研究發酵時間、接種量、接種比例與發酵溫度對大麥仁發酵品質的影響。

1.2.4.1 發酵時間 分別稱取0.5%(w/w,發酵劑與瀝干大麥仁質量之比)的米根霉和0.15%(w/w,發酵劑與瀝干大麥仁質量之比)的植物乳桿菌發酵劑,采用煮沸冷卻自來水(瀝干大麥仁質量10%)混勻后與大麥仁攪拌均勻。發酵溫度30 ℃,發酵時間依次選擇24、30、36、42和48 h,發酵結束后進行酸度甜度測定和感官評定,以感官評定得分為指標確定最佳發酵時間。

1.2.4.2 接種量 在上述優化時間基礎上,設定米根霉接種量(w/w)依次為0.1%、0.25%、0.5%和1%,接種比例10∶1(米根霉∶乳酸菌,w/w),發酵溫度30 ℃,發酵結束后進行酸度甜度測定和感官評定,以感官評定得分為指標確定最佳接種量。

1.2.4.3 接種比例 在上述優化時間和接種量基礎上,設定接種比例(米根霉∶乳酸菌,w/w)依次為20∶1、10∶1、10∶2、10∶3和10∶4。發酵溫度30 ℃。發酵結束后進行酸度甜度測定和感官評定,以感官評定得分為指標確定最佳接種比例。

1.2.4.4 發酵溫度 在上述優化時間、接種量和接種比例基礎上,設定發酵溫度依次為26、28、30、32和34 ℃。發酵結束后進行酸度甜度測定和感官評定,以感官評定得分為指標確定最佳發酵溫度。

1.2.5 正交試驗設計 以發酵時間、接種量、接種比例和發酵溫度為試驗因素(分別以A、B、C、D 表示),以感官得分為指標進行正交試驗,試驗因素水平見表1,每組3個重復。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.6 總酸含量與還原糖含量的測定 總酸含量測定[12]:準確稱取2 g樣品,向其中加入10 mL無二氧化碳蒸餾水。研磨樣品至勻漿后定容至25 mL。然后采用0.1 mol/L NaOH標準溶液進行滴定。總酸含量定義為1 g樣品所含酸的百分含量,以乳酸%(w/w)計。

還原糖含量測定[13]:準確稱取1 g樣品,向其中加入50 mL蒸餾水搗研至勻漿。3800 r/min離心15 min,取上清液定容至250 mL作為樣品待測液。然后吸取1 mL樣品待測液,采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量。

1.2.7 感官評定 感官評定由本學院12名以上教師和學生進行,感官評分表見表2。最終評分為所有打分平均值。

表2 感官評定表Table 2 Table of sensory evaluation score

1.2.8 總酚及體外抗氧化活性分析

1.2.8.1 總酚提取及含量測定 大麥仁多酚的提取參考付曉燕等[14]的方法略作修改。分別將發酵36 h和接種后未發酵大麥仁采用真空冷凍干燥機凍干,然后使用粉碎機粉碎后過100目篩備用。分別稱取發酵前后大麥仁凍干粉2.5 g,按料液比1∶10 (m/v)加入80%的乙醇溶液,置于50 ℃水浴中超聲(315 W)提取4 h。之后將提取液于4 ℃、10000×g條件下離心15 min,將上清液于旋轉蒸發儀上回收乙醇,濃縮樣品,添加去離子水定容至25 mL待測。總酚的測定采用 Folin-Ciocalteau法進行測定[15],含量以沒食子酸當量表示。

1.2.8.2 羥基自由基清除活性測定 采用Liu等[16]方法。取1 mL上述總酚提取液,依次加入1 mL 1,10-菲咯啉、1.5 mL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4和1 mL 0.01% H2O2,混合物于37 ℃反應30 min后測定536 nm處的吸光值。用去離子水代替樣品作為空白對照。按以下公式計算羥基自由基清除率:

羥基自由基清除率(%)=(A1-Ao)/(A′-Ao)× 100

式中,Ao為對照實驗的吸光度值;A1為樣品實驗的吸光度值;A′為以水代替H2O2和樣品的吸光度值。

1.2.8.3 DPPH自由基清除活性測定 采用Wang等[17]方法。取2 mL總酚提取液與2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液(80%甲醇溶解)混勻,室溫下暗反應30 min后測定517 nm處的吸光度值。用去離子水代替樣品作為空白對照。按下列公式計算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=(Ao-A1)/Ao× 100

式中,Ao為空白對照實驗的吸光度值;A1為樣品反應的吸光度值。

1.3 數據處理

實驗數據均為3次重復實驗結果的平均值,結果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS 18.0軟件對數據進行顯著性分析,p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 浸泡時間和蒸煮時間的選擇

2.1.1 浸泡時間對大麥仁吸水率的影響 浸泡可使大麥仁吸水膨脹,便于后續蒸煮時淀粉充分糊化。由圖1可知,大麥仁吸水率隨浸泡時間增加而增大,0～4 h吸水率增長速率較快,4～8 h吸水率增長速率變緩,8 h后基本無變化(p>0.05),說明已經達到飽和狀態。所以選擇大麥仁浸泡時間為8 h,此時吸水率為55.87%±1.19%。

圖1 浸泡時間對吸水率的影響Fig.1 Effect of soak time on water absorption注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.1.2 蒸煮時間對大麥仁熟度的影響 經過多次試驗得出，大麥仁的最佳煮制時間為沸騰后繼續水煮10 min,此時麥粒完全熟透,有彈性,有濃郁麥香,內無白心。所以后續煮制大麥仁都以10 min為標準。

2.2 單因素結果與分析

2.2.1 發酵時間對還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖2可知,還原糖含量隨發酵時間的增加先增大后減少,發酵36 h時達到最大值,為(18.49±0.25) g/100 g。導致這種現象的原因可能是發酵初始階段，米根霉產生的淀粉糖化酶將淀粉轉化為葡萄糖,還原糖含量升高,而隨著還原糖含量的升高,米根霉、乳酸菌會快速增殖,從而大量消耗還原糖,還原糖含量隨之逐漸降低;總酸含量在24 h后先減少后趨于穩定,在48 h達到最小值0.49%±0.01%。前期研究表明,發酵開始的前18 h,總酸含量隨發酵時間的延長而增加。這是因為乳酸菌和米根霉在發酵初期大量分解并利用碳水化合物產生乳酸等有機酸,而18 h后總酸開始下降,這與崔春等[18]的研究結果較為一致,他們對米根霉和乳酸菌混合制曲的研究結果也表明，在發酵后期,大曲的總酸會發生下降,這可能是因為霉菌在發酵后期消耗利用了一部分有機酸;感官得分隨發酵時間的增加先增大后減小,在接種量36 h時最高為(8.6±0.32)分。

圖2 發酵時間對還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.2 Effects of fermentation time on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.2 接種量對還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖3可知,還原糖含量隨接種量的增加而增大,其接種量1%時達到最大值,為(19.73±0.1) g/100 g,可能是因為米根霉接種量的增加提高了淀粉糖化酶的含量,從而導致還原糖含量的提高;總酸含量隨接種量的增加逐漸減小,在接種量1%時達到最小值0.36%±0.01%,造成這種結果的原因可能是米根霉數量的增加對乳酸菌造成了競爭性抑制;感官得分隨接種量的增加先增大后減小,在接種量0.5%時達到最高為(8.7±0.25)分。

圖3 接種量對還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.3 Effects of inoculation doses on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.3 接種比例對還原糖含量,總酸含量及其感官得分的影響 由圖4可知,還原糖含量隨接種比例的減小，先增大后減少,其最大值為接種比例10∶2時為(21.35±0.18) g/100 g;總酸含量隨接種比例的減小先增加后減小,然后再增大，并在10∶3時達到最小值0.53%±0.01%,在10∶4達到最大值0.77%±0.03%;感官得分隨接種比例的減小，先增大后減小,在10∶2時最高為(8.9±0.35)分。這表明接種比例對發酵大麥仁感官影響比較大,過大或過小,都不利于良好風味的形成。

圖4 接種比例對還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.4 Effects of inoculation proportion on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.2.4 發酵溫度對還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖5可知，還原糖含量隨發酵溫度的升高，先增加后降低最后逐漸上升,30 ℃時還原糖含量達到最高為(21.3±0.14) g/100 g。這可能是因為26～30 ℃米根霉酶活力隨溫度的升高而增大,還原糖含量呈增長趨勢,30～34 ℃米根霉酶活力隨溫度的升高而增小,還原糖含量有所下降;總酸含量隨發酵溫度的升高呈下降趨勢,34 ℃時最低為0.45%±0.01%;感官得分隨發酵溫度的升高，先增大后減小,在32 ℃時達到最高為(9.1±0.45)分。溫度太高大麥仁色澤發暗,米根霉產生黑色孢子,且表層硬度大,影響口感。

圖5 發酵溫度對還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on reducing sugar content,total acidity and sensory scores

2.3 正交試驗結果

正交試驗分析結果顯示(表3),對發酵大麥仁感官評分的影響大小順序為因素C>D>A>B,最優組合為A2B2C3D2,即發酵時間36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發酵溫度32 ℃。

表3 L9(34)正交試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results of L9(34)orthogonal test

該條件下獲得的發酵大麥仁呈淡黃色,表面有少量白色菌絲,有淡淡的酒香味,酸甜適口,軟硬適中(見圖6)。感官評定得分為(9.3±0.35)分,感官得分優于未優化工藝。因此大麥仁發酵最佳工藝參數為室溫浸泡8 h,蒸煮10 min,發酵時間36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發酵溫度32 ℃。

圖6 未發酵和發酵大麥仁照片Fig.6 Photos of unfermented and fermented dehusked barley注:A:未發酵;B:發酵。

2.4 總酚及抗氧化分析結果

多酚含量分析表明，發酵0和36 h大麥仁中總酚含量分別為(0.187±0.006)和(1.290±0.041) mg/g沒食子酸當量,這可能是因為在發酵過程中,微生物淀粉酶和蛋白酶等水解酶的作用，使得與細胞結構結合的多酚物質得以釋放[19]。

體外抗氧化活性分析表明(見圖7),各樣品對羥自由基和DPPH自由基均具有一定的清除能力,并呈現一定的劑量依賴關系。在同等濃度條件下,發酵36 h大麥仁凍干粉提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力明顯增強,發酵大麥仁(100 mg)提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力，分別由發酵前的2.08%±1.29%和34.96%±0.97%增加至93.38%±0.88%和80.18%±1.58%,且抗氧化能力呈現出一定的劑量依賴關系。這表明發酵對大麥仁抗氧化能力的提升有著明顯的促進作用。研究表明大麥多酚含量較高,主要包括香草酸、香豆酸、阿魏酸、原兒茶酸和蘆丁等。這些多酚物質以自由和結合兩種形式存在,小分子自由多酚具有較高的抗氧化性,發酵的作用主要體現在改變多酚物質的結構和種類,使結合態多酚化合物變為游離態,從而提高其抗氧化等生物活性[11]。Hole等[20]和姚芳等[11]發現L.plantarum、L.johnsonii和L.reuteri等乳酸菌發酵可以顯著增加大麥中游離沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸和香豆酸的含量,而L.plantarum發酵還可導致大麥中香草酸和對香豆酸含量的顯著減少。這可能是因為一些乳酸菌可以通過脫羧和/或還原反應將這些酚類物質轉化為其他酚化合物[19]。本研究也采用了植物乳桿菌作為發酵劑,因此,大麥仁中的酚化合物有可能發生了與上述研究相似的轉化過程。

圖7 發酵前后大麥仁提取液的羥基自由基和DPPH自由清除活性Fig.7 Scavenging rates of dehusked barley before and after fermentation on hydroxyl radical and DPPH radical

3 結論

通過實驗得出，米根霉和乳酸菌混合固態發酵大麥仁的最佳工藝條件為浸泡8 h,蒸煮10 min,發酵36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發酵溫度32 ℃。該條件下得到的發酵大麥仁呈淡黃色,有淡淡的酒香味,酸甜適口,軟硬適中,感官評定得分為(9.3±0.35)分(滿分:10分)。體外抗氧化活性分析表明,發酵可以顯著提升大麥仁的抗氧化活性,發酵大麥仁(100 mg)提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力，分別由發酵前的2.08%± 1.29%和34.96%±0.97%增加至發酵后的93.38%±0.88%和80.18%±1.58%。因此,利用乳酸菌和米根霉混合固態發酵生產大麥仁發酵食品，可以為大麥功能性食品的開發提供新的思路和途徑。