響應面法優化‘鳳丹’牡丹花瓣多酚提取工藝

,, ,雅君, ,麗培,

(1.鄭州師范學院 河南鄭州 450044;2.河南職業技術學院 河南鄭州 450046)

牡丹籽油在2011年被認定為新資源食品,‘鳳丹’牡丹(Paeoniasuffruticosa‘Feng Dan’)是榨取牡丹籽油常用的品種之一,隨著牡丹籽油的急性肝損傷保護[1]、抗糖尿病[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、防曬[5]等保健功能[6]逐漸被人們重視,其種植面積將逐年擴大。‘鳳丹’牡丹花量較大,應將過多的花疏除，以保證牡丹籽的飽滿程度與產量,疏除后的未完全盛開的牡丹花干化后可泡茶飲用。多酚是一種常見的生物活性物質,相關研究文獻[7-8]較多,近來還發現多酚對阿爾茨海默病[9]、體外抗脂質過氧化[10]等有一定作用,也有文獻表明芍藥花[11]與灰樹花[12]的多酚均有特殊功能。超聲提取技術是利用超聲波的機械效應、空化效應和熱效應來增大介質分子的運動速度,增大介質的穿透力以提取生物有效成分[13],與常見的溶劑萃取法、超臨界萃取和高壓快速提取技術相比,超聲提取法具有操作簡便、安全、成本低、提取時間短、提取率高等特點[14],目前已經廣泛運用到多種植物如葡萄[15]、石榴[16]、蘋果[17]、板栗[18]的特定組織多酚的提取。響應面法是一種成熟的優化若干個因素組合，以達到響應值最大化的常用方法,在蒲公英[19]、核桃枝[20]、三七[21]、梔子[22]等多酚的提取工藝優化中已有較好的應用。

國內外暫無牡丹花瓣多酚提取的相關研究,本研究擬以響應面法優化‘鳳丹’牡丹花瓣多酚的超聲提取工藝,以期為‘鳳丹’牡丹副產物的綜合利用與牡丹產業的深層次發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘鳳丹’牡丹花 以2016年5月采摘的六年生實生苗‘鳳丹’牡丹花瓣為試驗材料,每株取1～2朵花,每朵取花瓣1～2瓣,挑選無病蟲害,生長正常,大小一致,無明顯機械傷的花瓣放于冰盒，于4 h內運至實驗室,放置于4 ℃冰箱保存備用。沒食子酸 上海圻明生物科技公司;福林酚試劑 上海荔達生物科技有限公司;無水碳酸鈉等 均為分析純。

T6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TH-250B型數控超聲波清洗機 濟寧天華超聲電子儀器有限公司;FOSS SCINO CT410旋風式粉碎磨 杭州嘉偉創新科技有限公司;DHG-9140型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;TGL16M冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司;JA3003N型電子天平 上海菁海儀器有限公司;BCD-216ZDJ型冰箱 青島海爾股份有限公司;MINI型超純水機 湖南科爾頓水務有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理方法 將‘鳳丹’牡丹花瓣置于80 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重,取出后置于旋風式粉碎磨，制粉,過100目篩后，置于棕色磨砂廣口瓶內并密封,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 單因素實驗 設定超聲時間35 min,超聲功率80 W,乙醇體積分數70%時,分別用30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g的液料比提取花瓣多酚,考察液料比對花瓣多酚提取的影響。

設定液料比50∶1 mL/g,超聲功率80 W,乙醇體積分數70%時,分別用5、20、35、50、65 min的超聲時間提取花瓣多酚,考察超聲時間對花瓣多酚提取的影響。

設定液料比50∶1 mL/g,超聲時間35 min,乙醇體積分數70%時,分別用60、70、80、90、100 W的超聲功率提取花瓣多酚,考察超聲功率對花瓣多酚提取的影響。

設定液料比50∶1 mL/g,超聲時間35 min,超聲功率80 W時,分別用體積分數為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取花瓣多酚,考察乙醇體積分數對花瓣多酚提取的影響。

1.2.3 響應面法優化提取多酚 在單因素實驗基礎上,以液料比、超聲時間、超聲功率和乙醇體積分數為自變量,以‘鳳丹’牡丹多酚含量為響應值,設計4因素3水平的響應面分析試驗,從而得到最佳提取工藝。四個因素的編碼水平見表1。

根據表1的自變量編碼水平,設計響應面分析試驗,見表2,共29個試驗點,其中5個為中心點,在各個影響因素均為零水平的基礎上重復5次試驗,用來估計試驗誤差,其它的24個試驗點為析因點,用來分析A液料比、B超聲時間、C超聲功率、D乙醇體積分數四個因素對‘鳳丹’牡丹花瓣多酚含量的影響。

表1 自變量因素編碼及水平Table 1 Independent variable codings and levels

1.2.4 多酚含量的測定

1.2.4.1 沒食子酸標準曲線的制作 參考蔡慶生[23]的方法,配制濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸標準液。分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的沒食子酸標準液于試管,分別加入蒸餾水6、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0 mL,加入福林酚試劑1 mL,最后加入3 mL 7.5%的碳酸鈉溶液。充分搖勻后靜置反應2 h。在765 nm測定吸光值,同時做空白對照,并計算得線性回歸方程:y=0.0148x-0.0186,R2=0.9979,其中y為吸光度值,x為沒食子酸含量(μg/mL),試驗結果顯示沒食子酸含量在10～50 μg/mL之間與吸光值有良好的線性關系。

1.2.4.2 樣品多酚含量的計算 根據標準曲線計算每克樣品中多酚含量。

式中,m為根據標準曲線計算的多酚的質量(mg);V0為多酚提取液的體積(mL);N為提取液稀釋倍數;V為多酚提取液總體積(mL);W為所取樣品的質量(g)。

1.3 數據統計與分析

數據采用Microsoft office Excel 2010進行計算并作圖,采用軟件Design-Expert 7.0以‘鳳丹’牡丹花瓣多酚含量為響應值,進行多元回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對多酚含量的影響 由圖1可知,隨著液料比的增加,多酚的含量先增大,說明增大溶劑的體積利于花瓣中多酚的溶出,當液料比增加至40∶1 mL/g時,多酚含量達到最大值,當液料比超過40∶1 mL/g時,多酚含量開始下降,說明多酚在提取液中已經達到飽和并有分解或破壞趨勢,這與李娜等[24]、伍春等[25]的研究結果一致。另外,液料比過大會造成試劑浪費,綜合考慮，確定適宜提取液料比為40∶1 mL/g。

圖1 液料比對牡丹花瓣多酚含量的影響Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on the extraction of polyphenols

2.1.2 超聲時間對多酚含量的影響 由圖2可知,花瓣多酚含量在35 min時達到最大值,在此之后隨著時間的增加，多酚含量呈現下降趨勢,原因可能是隨著超聲時間的延長,超聲震動使提取溶液溫度升高,在達到一定溫度時破壞了多酚結構,使多酚發生降解等反應[26],從而導致‘鳳丹’牡丹花瓣多酚含量降低。因此,將35 min作為提取‘鳳丹’牡丹花瓣多酚的適宜提取時間。

圖2 超聲時間對牡丹花瓣多酚含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols

2.1.3 超聲功率對多酚含量的影響 由圖3可知,超聲功率在60～100 W之間時,隨著超聲功率的增加,多酚的含量增大,當超聲功率在70 W時,多酚含量達到最大,之后有所下降。在相同的時間內,超聲波功率越大,升溫越快,溫度增高使固液擴散速度加快,有利于多酚成分的溶出[27],但當溫度過高時,會破壞多酚的結構,使多酚發生降解反應,從而降低了多酚的含量。因此,提取‘鳳丹’牡丹花瓣多酚的適宜超聲功率為70 W。

圖3 超聲功率對牡丹花瓣多酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of polyphenols

2.1.4 乙醇體積分數對多酚含量的影響 由圖4可知,隨著乙醇體積分數的增加，多酚含量呈現先升高后下降的趨勢,在體積分數達到70%時,‘鳳丹’牡丹多酚含量達到最大值。當乙醇的體積分數較低時，不足以破壞氫鍵或者破壞不夠完全,從而減少多酚的溶出,使多酚的含量降低;當乙醇的體積分數過高時,降低了極性,從而影響多酚提取,使含量下降[28]。由圖4可知多酚含量相對較高的乙醇體積分數范圍在50%～70%之間。

圖4 乙醇體積分數對牡丹花瓣多酚含量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗 響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 響應面模型建立與方差分析 建立以A、B、C、D為自變量的關于多酚含量Y的多元二次回歸模型,用Design-Expert7.0軟件對表2中29個響應值進行擬合,得到如下方程:

Y=51.632+1.622A-1.128B+1.839C+1.110D+0.012AB-0.984AC-0.302AD+0.929BC+0.140BD-0.029CD-1.130A2-1.370B2-2.967C2-1.514D2

由表3可得,模型極顯著(p<0.01),失擬項p值為0.5806不顯著,表明該方程具有較高的擬合度,試驗誤差小,該方程的一次項A、B、C、D和二次項A2、B2、C2、D2均表現出極顯著差異(p<0.01),因素AC、BC差異極顯著(p<0.01),AB、AD、BD、CD差異不顯著(p>0.05)。由F值可知,四個因素對‘鳳丹’牡丹花瓣多酚含量的影響依次為C(超聲功率)>A(液料比)>B(超聲時間)>D(乙醇體積分數)。綜上所述此模型具有應用意義,可用于試驗分析。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

2.2.3 響應面曲面圖分析 響應面曲面圖和等高線圖見圖5,由每兩種試驗因素與響應值構成的曲面圖,曲面圖反映了四個變量因素液料比、超聲時間、超聲功率和乙醇體積分數,當其中任意兩個變量取零水平時,另外兩個因素對‘鳳丹’牡丹花瓣多酚含量的影響。曲面圖坡度越陡(即等高線越密集),說明條件變化對多酚含量的影響越大;若坡度較平緩(即等高線越稀疏),則條件變化對響應值的影響越小。等高線圖是由多條封閉曲線構成,在同一條曲線上多酚的含量相同,在封閉曲線的中心多酚含量最高,越靠近外圍多酚含量越低,由中心到邊緣整體呈遞減趨勢。等高線圖的封閉曲線越圓,表明這兩種因素相互影響作用越小;若等高線越趨近于橢圓狀,則說明這兩種因素相互影響作用越大[29]。

根據以上響應曲面的特征,對圖5所有曲面圖進行分析,可得超聲功率和液料比(圖5b),超聲功率和超聲時間(圖5f)之間存在顯著的交互作用,其他因素交互作用不顯著。由圖5b可知,液料比較低時,等高線相對密集,說明在液料比低時,超聲功率對多酚含量有顯著影響,增大超聲功率可以提高多酚含量。當超聲功率到達一定值時,增大液料比對多酚含量的影響不大。由圖5f可知,當超聲時間比較低時,增大超聲功率對提高多酚含量有顯著影響,當超聲時間達到一定值時,增大超聲功率,多酚含量也不會明顯提高。

圖5 任意兩個變量交互作用的響應曲面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction between two arbitrary variables注:a:超聲時間和液料比的交互作用;b:超聲功率和液料比的交互作用;c:乙醇體積分數和液料比的交互作用;d:乙醇體積分數和超聲時間的交互作用;e:乙醇體積分數和超聲功率的交互作用;f:超聲功率和超聲時間的交互作用。

2.2.4 提取多酚最佳組合工藝的確定及驗證 對建立的二次回歸方程求最大值,得到超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹花瓣多酚的理論最佳工藝為:液料比43.05∶1 mL/g,超聲時間29.9 min,超聲功率71.5 W,乙醇體積分數62.9%。在此條件下,多酚的理論提取值為52.621 mg/g。考慮實際情況,調整液料比為43∶1 mL/g,超聲時間為30 min,超聲功率為72 W,乙醇體積分數為63%,以此為最佳工藝條件進行5次平行試驗進行驗證,測得‘鳳丹’牡丹花瓣的多酚含量為(52.111±1.752) mg/g,與預測值的相對誤差為0.969%,證明響應面優化得到的工藝條件準確可靠,可用于‘鳳丹’牡丹花瓣多酚提取預測。

3 結論與討論

以乙醇為提取溶劑,采用超聲輔助法提取‘鳳丹’牡丹花瓣多酚,在四個單因素試驗的基礎上,通過響應面試驗設計建立多酚含量的多元二次回歸方程模型,并對方程分析,優化出提取多酚的最佳工藝條件:液料比43∶1 mL/g,超聲30 min,超聲功率72 W,乙醇體積分數為63%,在最佳條件下,多酚含量為(52.111±1.752) mg/g,達到回歸模型理論值(52.621 mg/g)的99.031%,相對誤差值是0.969%,說明響應面法優化建立的回歸方程模型科學可靠。