退化和正常窖泥微生物多樣性的比較分析

,,,,,,*

(1.湖北文理學院食品科學技術學院,鄂西北傳統發酵食品研究所,湖北襄陽 441053)2.湖北古襄陽酒業有限公司,湖北襄陽 441100)

根據生產工藝的差異,白酒可以分為濃香型、醬香型、清香型和米香型四種主體香型,其中濃香型白酒的產量占整個白酒行業的70%左右[1]。濃香型白酒主要采用泥窖固態發酵,窖泥中蘊含著豐富的微生物群系,棲息著大量的乳酸菌、丁酸菌和己酸菌等功能菌,其質量在很大程度上決定了酒的品質[2]。在濃香型白酒釀造過程中,由于窖泥中的營養物質不斷被微生物吸收和利用,同時有害物質不斷積累,進而導致窖泥出現退化現象,從而影響了白酒的品質。目前,常從色澤、氣味、手感及質地等維度對窖泥的質量進行判定,但由于感官指標的滯后性使多數生產或研究人員較難及時預測窖泥的質量[3]。

窖泥微生物群落組成及多樣性反映了窖泥質量,且具有對外界環境響應比較迅速的特點[4]。通過采用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)技術,Liang等[5]對四川特別是瀘州市成熟及退化窖泥微生物構成進行了解析,結果發現，正常窖泥與退化窖泥的微生物群落結構存在顯著差異,證實了通過微生物群落組成預測窖泥質量的可行性。相對于DGGE等指紋圖譜技術,高通量測序技術克服了指紋圖譜條帶信息量低和無法實現樣品間平行分析的缺陷[6],具有通量高和拼裝結果準確的優點,目前已經在泡菜[7]、臘腸[8]和酸奶[9]等發酵食品中有了廣泛的應用。Hu等[10]應用Miseq技術對江蘇湯溝濃香型白酒優質、普通和退化窖泥中細菌多樣性進行了分析,研究發現隨著窖泥質量的提升,Lactobacillus(乳酸桿菌)含量顯著減少,而Clostridia(梭菌)和Bacteroidia(擬桿菌)等核心屬的含量明顯增加。作為國內白酒生產與消費的重要省份,湖北省白酒生產企業近450家,銷售收入近800億元[11],然而目前關于湖北地區濃香型白酒退化和正常窖泥微生物多樣性比較分析的研究報道尚少。

本研究從湖北古襄陽酒業正常窖池和廢棄窖池中各采集了5份窖泥樣品,在提取宏基因組DNA的基礎上,使用Miseq高通量測序技術對其細菌多樣性進行了解析,同時結合多元統計學方法,對與2類窖泥細菌群落結構差異顯著相關的關鍵細菌類群進行了甄別,通過本項目的實施以期為華中地區窖泥質量預測和窖泥微生物群落結構優化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

窖泥 分別采集自湖北古襄陽酒業新舊窖泥車間;E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒 美國OMEGA公司;10×PCR緩沖液、DNA聚合酶和dNTPs Mix 寶生物工程(大連)有限公司;引物338F/806R(其中正向引物前端加入7個核苷酸標簽) 由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司;Miseq PE300型高通量測序平臺 美國Illumina公司;FluorChem FC3型化學發光凝膠成像系統 美國FluorChem公司;5810R型臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DYY-12型電泳儀 北京六一儀器廠;ND-2000C型微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;R920型機架式服務器 美國DELL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集及DNA提取 從湖北古襄陽酒業有限公司新舊窖泥車間各選取5個窖池,從窖底取300 g窖泥裝入無菌采樣袋中低溫運送回實驗室,采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒進行微生物宏基因組DNA提取。舊窖泥車間窖池窖齡均為30年,由于新廠搬遷舊窖池已2年未使用,但均填充酒糟并覆蓋窖皮泥進行密封。新窖池窖齡為2年,新舊窖池距離約5 km,且深度均為2.2 m。其中退化窖泥組5個樣品分別命名為D1、D2、D3、D4和D5,正常窖泥組5個樣品分別命名為N1、N2、N3、N4和N5。

1.2.2 細菌16S rDNA序列PCR擴增及高通量測序 擴增體系為:DNA模板10 ng,10×PCR緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL,5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL,5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL,體系用ddH2O補充至20 μL。擴增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環,72 ℃ 10 min。檢測合格的PCR產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司使用Miseq PE300平臺進行高通量測序。

1.2.3 序列質控 將下機序列拼接后依照核苷酸標簽(barcode)信息劃分到各樣品,同時將barcode和引物予以切除進而得到高質量的序列。拼接過程中序列應滿足如下要求,否則予以刪除:重疊區大于等于10 bp;最大錯配比率小于等于0.2;barcode堿基無錯配;引物堿基錯配數小于等于2 bp。

1.2.4 生物信息學分析 采用QIIME(v1.70)平臺[12]進行2類窖泥細菌物種分析和多樣性評價。主要的處理流程為:a.采用PyNAST校準并把序列排齊[13];b.采用兩步UCLUST法依次按照100%和97%相似性進行無重復的單一序列集和分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)構建[14];c.應用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU[15];d.從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列,使用RDP(Ribosomal database project,Release 11.5)[16]和Greengenes(Release 13.8)[17]數據庫進行序列同源性比對,在門、綱、目、科和屬水平上對其分類學地位進行明確。若隸屬于某一門或屬的樣品在10個窖泥樣品中的平均相對含量大于1.0%,則將其定義為優勢門或屬[18]。e.從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列,使用FastTree軟件繪制系統發育進化樹[19],并對超1指數(Chao1 index)和香農指數(Shannon index)等α多樣性指數進行計算[20]。f.基于UniFrac距離[21]進行主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA)和非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚類分析,進而完成不同樣品間細菌群落結構的β多樣性分析。

1.2.5 核酸登錄號 序列數據提交至MG-RAST數據庫(http://metagenomics.anl.gov/),登錄號為mgp83663。

1.2.6 多元統計學分析 使用Mann-Whiney檢驗對2類窖泥微生物群落的超1指數、香農指數、優勢細菌門和屬平均相對含量進行顯著性分析;采用多元方差分析(Multivariate analysis of variance,MANOVA)對2類窖泥細菌群落結構差異性進行分析;采用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)對與2類窖泥細菌群落結構差異顯著相關的關鍵類群進行甄別;采用歐式距離對2類窖泥細菌群落結構組間差異進行計算。使用Canoco 4.5軟件繪制RDA圖,使用Matlab 2010b軟件繪制熱圖,使用Mega5.0軟件繪制系統發育樹,其他圖使用Origin 8.6軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

在提取窖泥微生物宏基因組DNA的基礎上,本研究采用Miseq高通量測序技術對2類窖泥細菌群落結構進行了解析,10個樣品共產生280822條高質量序列,平均每個樣品28082條。在使用PyNAST將序列對齊時,有840條序列比對失敗,因而共有279982條序列進行了OTU的劃分。10個窖泥樣品16S rDNA V4～V5區序列測序情況及各分類地位數量如表1所示。

表1 樣品16S rDNA測序情況及各分類地位數量Table 1 16S rDNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

由表1可知,本研究采用兩步UCLUST法進行了OTU的劃分,根據序列100%相似性聚類分析后,挑選出了100439條代表性序列,根據序列97.0%相似性聚類分析后,得到了14368個OTU,經嵌合體檢查后去除了6762個OTU,還剩余7606個OTU,平均每個樣品1339個。在OTU劃分的基礎上,本研究將序列鑒定為26個門、66個綱、108個目、233個科和524 屬,其中有0.034%和14.31%的序列不能鑒定到門和屬水平。經過序列比對和嵌合體去除后,含有序列數最少的樣品有18588條序列,故而在進行α多樣性計算時,所有樣品測序深度均取18510條序列。經Mann-Whiney檢驗發現,退化窖泥微生物群落的超1指數和香農指數均顯著高于正常窖泥(p<0.05),這說明窖泥退化后其細菌的多樣性和豐度均會顯著提升。

2.2 基于各分類學地位相對含量的2類窖泥細菌構成研究

在序列豐富度和多樣性分析的基礎上,本研究進一步基于分類學地位“門”和“屬”水平對窖泥細菌構成進行了揭示,2類窖泥中優勢細菌門相對含量的比較分析如圖1所示。

圖1 2類窖泥中優勢細菌門相對含量的比較分析Fig.1 Relative abundances of the majorbacterial phyla among 2 types pid mud samples

由圖1可知,退化窖泥中平均相對含量大于1.0%的細菌門及其含量分別為:Firmicutes(硬壁菌門,68.70%)、Bacteroidetes(擬桿菌門,13.80%)、Spirochaetes(螺旋體門,4.86%)、Synergistetes(互養菌門,3.70%)、Chloroflexi(綠彎菌門,3.53%)、Proteobacteria(變形菌門,1.84%)和Actinobacteria(放線菌門,1.89%)。正常窖泥中平均相對含量大于1.0%的細菌門及其含量分別為:Firmicutes(硬壁菌門,86.79%)、Proteobacteria(變形菌門,6.28%)、Actinobacteria(放線菌門,4.65%)和Bacteroidetes(擬桿菌門,1.29%)。經Mann-Whiney檢驗發現,退化窖泥中Spirochaetes(螺旋體門)、Synergistetes(互養菌門)和Chloroflexi(綠彎菌門)相對含量顯著高于正常窖泥(p<0.05)。2類窖泥中優勢細菌屬相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 2類窖泥中優勢細菌屬相對含量的比較分析Fig.2 Relative abundances of the major bacterial genera among 2 types pid mud samples

由圖2可知,退化窖泥中平均相對含量大于1.0%的細菌屬及其含量分別為:隸屬于Firmicutes(硬壁菌門)的Clostridium(梭菌,14.77%)、Syntrophaceticus(12.01%)、Syntrophomonas(互營單胞菌屬,8.21%)、Sedimentibacter(沉淀桿菌屬,3.93%)、Lysinibacillus(梭形桿菌屬,3.11%)、Pelotomaculum(2.05%)和Lactobacillus(乳酸桿菌,1.01%);隸屬于Bacteroidetes(擬桿菌門)的Petrimonas(6.01%);隸屬于Synergistetes(互養菌門)的Aminobacterium(胺小桿菌屬,4.08%)。正常窖泥中平均相對含量大于1.0%的細菌屬及其含量分別為:隸屬于Firmicutes(硬壁菌門)的Lactobacillus(乳酸桿菌,67.91%)、Clostridium(梭菌,4.49%)和Bacillus(芽孢桿菌,3.80%);隸屬于Proteobacteria(變形菌門)的Ralstonia(雷爾氏菌屬,3.65%)和隸屬于Actinobacteria(放線菌門)的Nocardia(諾卡氏菌屬,2.41%)。

經Mann-Whiney檢驗發現,退化窖泥中Clostridium(梭菌)、Syntrophaceticus、Syntrophomonas(互營單胞菌屬)、Petrimonas、Sedimentibacter(沉淀桿菌屬)、Aminobacterium(胺小桿菌屬)、Lysinibacillus(梭形桿菌屬)和Pelotomaculum的相對含量顯著高于正常窖泥(p<0.05),而Lactobacillus(乳酸桿菌)、Bacillus(芽孢桿菌)、Ralstonia(雷爾氏菌屬)和Nocardia(諾卡氏菌屬)呈現出相反的趨勢(p<0.05)。

2.3 基于多元統計學分析的2類窖泥細菌群落結構的研究

在完成2類窖泥微生物構成解析的基礎上,本研究進一步采用基于OTU水平加權UniFrac距離的PCoA和UPGMA對10個窖泥樣品的β多樣性進行了揭示,基于分類操作單元加權UniFrac距離的主坐標分析如圖3所示。

圖3 基于分類操作單元加權UniFrac距離的主坐標分析Fig.3 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighted unifrac distance

由圖3可知,在以2個權重最高的主成分PC1和PC2作圖時,退化窖泥樣品分布在一四象限,而正常窖泥分布在二三象限,其中第1和第2主成分分別占全部變量72.22%和8.87%的權重。由此可見,退化窖泥和正常窖泥樣品在空間排布上呈現出明顯的區分,這說明兩者微生物群落結構可能存在較大差異。為了對這一結果進行驗證,本研究采用UPGMA對2類窖泥微生物群落結構進行了分析,結果如圖4所示。

圖4 基于分類操作單元加權UniFrac距離的UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighted unifrac distance

由圖4可知,聚類I由退化窖泥樣品構成,聚類II由正常窖泥樣品構成。由此可見,UPGMA結果與PCoA結果一致,即2類窖泥微生物群落結構可能存在較大的差異。在采用非監督多變量統計學方法進行分析的基礎上,本研究選取了PCoA前80%的PC進行了MANOVA,結果發現正常窖泥和退化窖泥微生物群落結構差異極顯著(p<0.001)。

由圖3亦可知,退化窖泥樣品的空間排布較之正常窖泥分散,這說明退化窖泥樣品微生物群落結構的組間差異可能要高于正常窖泥,本研究進一步基于歐氏距離對該推論進行了驗證,結果如圖5所示。

圖5 基于歐氏距離的2類窖泥細菌群落結構組間差異分析Fig.5 Differences in the bacterial community structure between 2 types pid mud samples calculated by euclidean distances

2.4 關鍵細菌類群的甄別

采用基于OTU水平加權UniFrac距離的PCoA和UPGMA分析發現,正常窖泥和退化窖泥微生物群落結構差異極顯著(p<0.01),本研究以窖泥分組(正常/退化)為起約束作用的解釋變量,以平均相對含量大于0.5% OTU為響應變量,采用RDA對導致2類窖泥微生物群落結構差異顯著的關鍵細菌類群進行了甄別。數據中有35.2%的變異度能夠被退化窖泥/正常窖泥分組所解釋,而通過蒙特卡羅置換檢驗發現這一約束因素具有顯著性(p<0.05)。RDA雙序圖如圖6所示。

圖6 RDA雙序圖Fig.6 Biplot of the RDA

由圖6可知,OTU11613、OTU2965、OTU1586、OTU5725、OTU9805、OTU7629、OTU2455、OTU4543和OTU1402共9個OTU與RDA排序圖約束軸上的樣本賦值良好相關,由此可見,9個OTU代表了2類窖泥微生物群落結構差異顯著相關的關鍵細菌類群。在RDA排序圖中可以看到,隸屬于Clostridium(梭菌)的OTU9805和OTU7629、隸屬于Syntrophomonas(互營單胞菌屬)的OTU2455、隸屬于Pelotomaculum的OTU4543和隸屬于Synergistaceae(互養菌科)的OTU1402位于圖的右側(即退化窖泥),這說明該5個OTU在退化窖泥中的相對含量可能較高;OTU11613、OTU2965、OTU1586和OTU5725 4個隸屬于Lactobacillus(乳酸桿菌)的OTU位于圖的左側(即正常窖泥),這說明該4個OTU在正常窖泥中的相對含量可能較高。9個關鍵OTU在各樣品中相對含量的熱圖如圖7所示。

圖7 9個關鍵OTU在各樣品中相對含量的熱圖Fig.7 Relative abundances of the 9 OTUs identified as key variables for the differentiation of microbiota in 2 types pid mud samples注:左側為系統發育樹。

由圖7可知,OTU9805、OTU1402、OTU7629、OTU2455和OTU4543在退化窖泥中的平均相對含量分別為2.57%、2.27%、1.36%、1.40%和1.20%,而在正常窖泥中平均相對含量亦均小于0.1%。與此相反,OTU11613在正常窖泥中的平均相對含量顯著高于退化窖泥,其在正常窖泥中含量為56.27%,而在退化窖泥中僅為0.70%。此外,OTU2965、OTU1586和OTU5725在正常窖泥中的平均相對含量分別為4.21%、4.09%和3.29%,而在退化窖泥中的含量均小于0.1%。Mann-Whitney檢驗的結果顯示,除均隸屬于Lactobacillus(乳酸桿菌)的OTU1586和OTU5725外,其他7個OTU在2類窖泥中的差異具有統計上的顯著性(p<0.05)。

3 討論與結論

窖泥的質量直接決定了濃香型白酒的質量,正常的窖泥為灰褐(黑)色,有較強的酯香味和微弱的硫化氫氣味,而退化窖泥為銀灰色或白色針狀晶體結塊,酯香氣較弱。雖然通過感官特征可以對窖泥的質量進行評價,但其變化較其中微生物群落組成及物種多樣性變化緩慢[11]。香農指數廣泛應用于生態系統穩定性的評價[22],窖泥微生物群落的多樣性受空間[23]和窖齡[24-25]的影響。本研究發現，退化窖泥細菌群落的香農指數均較之正常窖泥高。隨著窖泥的退化,優勢細菌微生物群落組成在原有Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)4 個門的基礎上,又增加了Spirochaetes(螺旋體門)、Synergistetes(互養菌門)和Chloroflexi(綠彎菌門)3個門,同時優勢細菌屬也從5個增加到9個。通過對江蘇湯溝濃香型白酒優質、普通和退化窖泥中細菌多樣性進行對照分析,Hu等[10]發現，正常窖泥細菌群落的香農指數高于退化窖泥而與優質窖泥差異不顯著,其研究結論與本研究不同的原因可能在于兩個研究中退化窖泥的選擇不同,Hu選擇的退化窖泥采集自尚在使用中的窖池,而本研究采集的退化窖泥來自已2年未使用的窖池。

作為正常窖泥中的優勢菌,本研究發現Lactobacillus(乳酸桿菌)的平均含量高達67.91%。雖然有研究指出乳酸菌含量過高會影響窖泥的品質[11],但其產生的乳酸菌可與乙醇生成乳酸乙酯,同時對雜菌的生長亦有一定的抑制作用[26]。通過采用DGGE技術對瀘州老窖窖泥中的乳酸菌多樣性進行分析,熊亞等[27]發現耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)為窖泥中乳酸菌的優勢種群。王葳等[28]亦使用純培養方法從窖泥中分離出了L.zeae(玉米乳桿菌)、L.pentosus(戊糖乳桿菌)和Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)。通過產生己酸、丁酸和氫[29],梭菌對濃香型白酒香氣的形成亦起著重要作用[30],古襄陽酒業為了加快窖泥的熟化通常會向新窖池中加入梭狀芽胞桿菌。本研究發現退化窖泥中Clostridium(梭菌)的相對含量反而高于正常窖泥,這可能是由于Miseq高通量測序只能實現微生物屬的相對定量,因而在后續研究中進一步使用qPCR對窖泥中梭菌進行絕對定量是極為必要的。

本研究通過對與退化窖泥細菌群落結構差異顯著相關的關鍵細菌類群進行甄別,證實了細菌多樣性可以較為科學的判定窖泥質量,進而為后續窖泥質量優化和退化防止提供了一定的理論支撐。由于本研究的退化窖泥樣品采集自已兩年未使用的窖池,因此在后續研究中，從正在使用的窖池中采集退化窖泥樣品,并對其細菌多樣性進行揭示,從而進一步檢驗和完善本研究的結果是極為必要的。