超聲預處理對金槍魚皮膠原ACE抑制肽消化穩定性的影響及消化產物的分離純化、鑒定

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(西南大學食品科學學院,重慶 400715)

金槍魚是一種重要的經濟魚類,在全世界有很高的漁獲量,因口感細膩、營養豐富深受消費者的喜愛。金槍魚加工過程往往會產生占總重50%～70%左右的下腳料,這些下腳料一般加工為飼料或魚餌,經濟價值不高,還會造成一定的環境污染[1]。目前,金槍魚皮已被許多學者用于制備明膠[2-3]、膠原[4-5]和生物活性肽[6-7]等。

金槍魚皮含有豐富的膠原蛋白,三螺旋區域富含脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp),是制備ACE抑制肽的良好來源[8-9]。但膠原蛋白有特殊的三螺旋結構存在,三條肽鏈緊密地結合在一起,很難被金屬蛋白酶以外的酶酶解[10]。因此,如何破壞三螺旋結構,暴露肽鏈酶切位點是ACE抑制肽提取的關鍵步驟,通常需要對原料進行適當預處理。常采用的預處理方法有熱處理[11]、酸處理[12]、堿處理[13],這些方法操作復雜且耗時較長。超聲作為一種綠色能源可用于原料預處理,任曉峰等[14]研究了玉米醇溶蛋白制備ACE抑制肽,結果表明，掃頻超聲處理提高了ACE抑制肽制備效率和ACE抑制肽的活性。Uluko等[15]研究了從牛奶中提取ACE抑制肽的工藝,通過超聲預處理牛奶后,得到的ACE抑制肽分子量更小,活性比傳統方法的更高。

本課題組研究了從豬皮膠原蛋白制備ACE抑制肽的工藝,表明超聲處理可改變膠原蛋白構象特點,有利于ACE抑制肽的釋放[16]。黃丹丹等[17]研究證明對于結構較哺乳動物膠原蛋白簡單的大目金槍魚皮,采用單純超聲波預處理(功率30%(195 W)、工作/間歇時間為5 s/10 s)即可促進膠原ACE抑制肽的高效釋放。但其水解時間短,所獲水解液分子量較大,因此有必要對水解液的消化穩定性進行進一步研究,初步判斷此方式可以在消化后仍具有明顯ACE抑制活性。

本研究擬對超聲預處理金槍魚皮后,酶解得到的ACE抑制肽的消化穩定性進行評價,并篩選其中高活性水解液進行ACE抑制肽的分離純化和結構鑒定,旨在明確經胃腸消化后高ACE抑制活性多肽的一級結構及其來源,為超聲預處理是否可以提高三螺旋區活性肽的釋放效率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚魚皮 山東省中魯遠洋(煙臺)食品有限公司;ACE作用底物(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro) Bachem公司;胰蛋白酶(>250 unit/mg) Amresco公司;蛋白酶K(酶活為40 unit/mg)、胰凝乳蛋白酶(1200 unit/mg) 索萊寶生物科技公司;胃蛋白酶(3000 unit/mg)、ACE、葡聚糖凝膠G-15(Sephadex G-15)、細胞色素C、抑肽酶(1300 unit/mg)、桿菌肽、谷胱甘肽 Sigma公司;乙腈、三氟乙酸 成都市科龍化工試劑廠 色譜純;其他試劑 均為化學純。

QL-901型漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;5804R型臺式離心機 德國Eppendorf公司;FD-1-50型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;0.5 m×26 mm、1 m×10 mm層析柱 上海琪特分析儀器有限公司;BT1-100E型恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司;BSZ-100-LCD型自動部分收集器 上海琪特分析儀器有限公司;日立LC-2000型半制備液相色譜 日立高新技術公司;Q Exactive型質譜儀 Thermo Finnigan公司;上樣柱 Thermo scientific EASY column(2 cm×100 μm 5 μm-C18),分析柱 Thermo scientific EASY column(75 μm×100 μm 3 μm-C18)。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚皮酶解液的制備 稱取2 g金槍魚皮,加入0.1 mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液,進行超聲預處理,超聲預處理條件[17]:料液比為1∶15 (g/mL),超聲溫度為30 ℃,超聲功率為195 W,工作/間歇時間為5 s/10 s,超聲時間分別為0、1、5、20、40 min。未處理組不經超聲預處理。

金槍魚皮經超聲預處理后,按酶底比1 mg/g (W/W)加入蛋白酶K,置于37 ℃水浴恒溫振蕩器中分別酶解5、30、60 min,90 ℃水浴15 min滅酶,冷卻;6000 r/min離心15 min,用0.45 μm濾膜過濾上清液,即為酶解液,冷凍干燥制成凍干粉備用。

1.2.2 體外模擬消化 模擬胃消化道酶系:將金槍魚皮酶解液凍干粉復溶于蒸餾水中配成3%(V/V)的溶液,用1 mol/L的鹽酸調節pH為2.0,加入胃蛋白酶(添加量為凍干粉的4%),在搖床中恒溫(37 ℃)孵育2 h。沸水浴5 min滅酶,快速冷卻,離心15 min(9000 r/min),得到上清液,取10 mL上清液用于ACE抑制率測定,剰余上清液冷凍干燥備用。

模擬腸消化道酶系:金槍魚皮酶解液經過胃消化道酶系消化2 h后,用0.9 mol/L的NaHCO3調節反應體系pH為5.0,再用1 mol/L NaOH調節pH為7.5,加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(添加量為凍干粉的4%),在搖床中恒溫(37 ℃)孵育4 h。沸水浴5 min滅酶,快速冷卻,離心15 min(9000 r/min),得到上清液,取10 mL上清液用于ACE抑制率測定,剰余上清液冷凍干燥備用。

1.2.3 酶解物分子量分布的測定 取5 mg消化液凍干樣品溶于2 mL流動相中,采用HPLC法分析其多肽分子量分布的情況[18]。色譜柱:TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm);流動相:30%乙腈(含0.1%(v/v)三氟乙酸);流速:0.5 mL/min等度洗脫;檢測波長:220 nm;柱溫:30 ℃;上樣量:10 μL。

相對分子質量校準標準品:細胞色素C(Mw=12384 Da)、抑肽酶(Mw=6511.44 Da)、桿菌肽(Mw=1422.69 Da)、谷胱甘肽(Mw=612.63 Da)。

1.2.4 ACE抑制活性的測定 參照Sentandreu等[19-20]的方法,略有改動。取50 μL經體外模擬消化后的上清液于96孔黑色微量滴定板反應孔中,加入6 mU/mL ACE溶液50 μL后,將微量酶標板置于熒光酶標儀中,振蕩10 s,于37 ℃下反應10 min,之后再向微量滴定板每個反應孔中加入200 μL 0.45 mmol/L ACE底物反應液(ABZ-Gly-Phe(NO2)-Pro),于37 ℃開始動力學測定,在1 h內每隔1 min測量一次熒光值,其中熒光激發波長、吸收波長分別為360、415 nm。所有樣品均需重復3次。

式中:α表示熒光吸收值與測定時間回歸曲線的斜率。其中,陽性對照組用pH8.3 Tris緩沖液代替酶解液,陰性對照組、空白對照組用Tris緩沖液替代ACE溶液。

1.2.5 IC50值的測定 稱取適量消化液凍干樣品配制成不同濃度的溶液,按照ACE抑制率測定方法測定抑制活性,以濃度為橫坐標,ACE抑制率為縱坐標作圖,通過圖形計算出IC50值。

1.2.6 Sephadex G-15分離純化ACE抑制肽的分離純化 將60 g Sephadex G-15凝膠顆粒溶于5～10倍量去離子水中,充分溶脹后反復漂洗,去除表面懸浮小顆粒。凝膠懸液沿玻璃棒緩慢灌入柱中,恒流泵與層析柱相連接,用洗脫液沖洗柱子過夜使柱床穩定。

試驗前期對分離條件進行篩選,確定分離條件為:洗脫速度為0.5 mL/min,洗脫劑為蒸餾水,層析柱規格為1 m×10 mm。對經胃腸消化的酶解液進行分離,樣品濃度為100 mg/mL,加樣量為1 mL,使用洗脫液進行洗脫,每5 min收集一管,共收集70～80管。于280 nm檢測。對收集到的每個洗脫峰進行冷凍干燥處理,測定其ACE抑制率并計算IC50值。

1.2.7 反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化ACE抑制肽 試驗前期對分離條件進行初探,此時色譜條件:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm)色譜柱;樣品濃度為10 mg/mL,進樣量10 μL;柱溫30 ℃;檢測波長280 nm。最后確定半制備RP-HPLC流動相條件為:0～50 min 0%～30%乙腈梯度洗脫。

在上述分離條件的基礎上,進行半制備放大試驗,按照公式“放大倍數=(制備柱內徑/分析柱內徑)2×(制備柱柱長/分析柱柱長)”得到放大倍數為4.35,保持樣品濃度、流動相比例不改變,進樣量、流速按比例放大。半制備時色譜條件:色譜柱為ZORBAX 300 SB-C18(9.4 mm×250 mm);流速為4.35 mL/min;樣品濃度為10 mg/mL;進樣量為43.5 μL;柱溫為30 ℃;檢測波長為280 nm。確定半制備分離條件后,對Sephadex G-15分離獲得的ACE抑制肽進一步分離純化,多次重復進樣,洗脫時間相同的組分峰進行合并,冷凍干燥后測定其ACE抑制率并計算IC50值。

1.2.8 液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定ACE抑制肽氨基酸序列 采用LC-MS/MS法分析RP-HPLC純化獲得的ACE抑制肽[21]。色譜分析:使用FASP酶解處理樣品,毛細管高效液相色譜A液為純水(含0.1%甲酸),B液為乙腈(0.1%甲酸),色譜柱以95%的A液平衡后,樣品由自動進樣器上樣至Trap柱,洗脫過程為:0～50 min,4%～50% B;50～54 min,50%～100% B;54～60 min,100% B。

質譜分析:采用Q-exactive質譜儀進行測序,毛細管溫度為200 ℃,檢測方式為正離子,多肽和多肽的碎片的質量電荷比采集,每次全掃描后采集10個碎片圖譜,數據搜索為Mascot 2.2軟件。具體如下:先用正離子和自動獲得數據模式采集數據,一級質譜(MS)掃描范圍為1～1000 Da,再對其主峰進行二級質譜(MS/MS),質譜峰圖和數據用 Flex Analysis 3.4 軟件進行處理,并采Biotools的Rapi De Novo Squencing、Mascot squnence Query和Mascot MS/MS Ion Search進行氨基酸序列分析。

1.3 數據分析

采用Excel 2007、SPSS 18.0、Origin 8.0對數據進行處理,采用origin 8.0作圖,顯著性分析采用SPSS 18.0,選擇Duncans法進行比較。

2 結果與分析

2.1 超聲預處理對ACE抑制肽體外模擬消化后小分子含量的影響

本課題組研究大目金槍魚制備ACE抑制肽的工藝時,發現采用采用單純超聲波預處理(時間為20 min、功率30%(195 W)、工作/間歇時間為5 s/10 s)可促進膠原ACE抑制肽的高效釋放[17]。在前期研究上,首先比較了超聲0、20 min對制備得到的ACE抑制肽經體外模擬消化后的影響。將超聲0、20 min并在不同酶解時間條件下所制備的金槍魚皮酶解液進行體外模擬消化,經計算消化液3 kDa以下分子含量如圖1所示。各組酶解液經胃消化后3 kDa以下分子量增多;經胃腸消化后,基本完全被分解為小分子肽,3 kDa以下分子百分含量達到95%以上,這些3 kDa以下的小分子肽在小腸內直接被小腸上皮細胞吸收利用發揮其生理功效[22],說明經胃腸道消化的金槍魚皮酶解液易于消化吸收。

圖1 超聲預處理0、20 min對酶解液體外模擬消化的3 kDa以下分子含量的影響Fig.1 The effect on the molecular weight(under 3 kDa)distribution of tuna skin hydrolysate by ultrosonic pretreatmentfor 0,20 min before and after gastrointestinal digestion注:E表示酶解時間,U表示超聲預處理時間,如E5U0表示酶解5 min,超聲預處理0 min;圖中不同字母表示不同酶解時間樣品間差異顯著(p<0.05),下同。

2.2 超聲預處理對ACE抑制肽體外模擬消化后的ACE抑制活性的影響

對超聲0、20 min并在不同酶解時間條件下所制備的金槍魚皮酶解液進行體外模擬消化,消化液ACE抑制活性如圖2所示。超聲預處理組和未處理組酶解液經過胃腸道模擬消化后呈現相同變化規律,但E5U20組酶解液消化后ACE抑制活性明顯優于E5U0組,說明超聲預處理不僅利于短時酶解快速釋放ACE抑制肽,也利于酶解液在體內發揮ACE抑制活性功效。超聲預處理金槍魚皮后,酶解5 min酶解液即有較高的ACE抑制率,經體外消化后ACE抑制率達到80%以上,說明超聲預處理能有效縮短酶解時間,快速釋放活性肽。從經濟成本角度考慮,后期實驗以酶解5 min作為研究基礎,分析不同超聲預處理時間對酶解液的體外模擬消化的影響。

圖2 超聲預處理0、20 min對酶解液體外模擬消化的ACE抑制率變化的影響Fig.2 The effect on ACE inhibitory activity of tuna skin hydrolysate by ultrosonic pretreatment for 0,20 min before and after gastrointestinal digestion

2.3 超聲預處理時間對ACE抑制肽體外模擬消化的小分子量和ACE抑制活性的影響

對超聲時間為0、1、5、20、40 min,酶解時間為5 min的條件制備的金槍魚皮酶解液進行體外模擬消化,結果如圖3所示。經胃腸消化后,各組酶解液3 kDa以下分子百分含量均達到95%以上,酶解液都保留了ACE抑制活性,說明酶解液中ACE抑制肽對胃腸消化有一定的抗性作用。各組酶解液的ACE抑制率均有所增加,說明酶解液中ACE抑制肽一方面可以抵制消化酶的水解,另一方面可被消化酶降解釋放ACE抑制肽,因此口服這些酶解液就可能發揮降血壓作用。根據顯著性分析,E5U20和E5U40組胃腸消化后的酶解液中3 kDa以下分子百分含量與ACE抑制率與其他組相比有明顯提高,為進一步分析ACE抑制肽的一級結構特征,將經胃腸消化的E5U20、E5U40的酶解液進一步分離純化。

圖3 酶解5 min對金槍魚皮酶解液體外模擬消化的3 kDa以下分子含量和ACE抑制率變化的影響Fig.3 The effect on the molecular weight(under 3 kDa)distribution and ACE inhibitory activity of tuna skin hydrolysateby enzyme for 5 min before and after gastrointestinal digestion

2.4 Sephadex G-15分離純化結果及分離純化后各組分IC50值

對E5U20、E5U40體外消化凍干粉進行分離純化,將E5U20分離出的三個組分標記為G1、G2、G3;E5U40分離出的三個組分標記為F1、F2、F3,結果如圖4所示,分別收集各組分峰,冷凍干燥備用。

圖4 E5U20和E5U40的洗脫曲線Fig.4 The elution profile of E5U20 and E5U40

表1 Sephadex G-15分離E5U20、E5U40組分的IC50值Table 1 The IC50 of components separated E5U20 and E5U40 by Sephadex G-15

根據Sephadex G-15凝膠分離原理,這些組分分子量均小于1500 Da,ACE抑制肽多由2～12個氨基酸殘基組成,分子量小于1500 Da[23-24]。E5U20的三個組分中G1的分子量最大,G2分子量次之,G3分子量最小,同理E5U40組三個組分分子量大小的順序為F1>F2>F3。由表可知,E5U20組分離的樣品G2的IC50值最小,其次是G3,G1最大,這說明該方法使樣品得到較好的分離;E5U20組整體組分比E5U40組ACE抑制率效果好,因此,選用E5U20組G2進一步分離純化。

2.5 半制備RP-HPLC分離純化結果及分離純化后各組分IC50值

對E5U20組G2進一步進行分離純化,結果如圖5所示。G2分離得到8個峰,多次收集這8個組分,冷凍干燥備用。

圖5 半制備液相色譜分離純化圖譜Fig.5 Chromatogram of separated by semi-preparing RP-HPLC

由RP-HPLC分離出的8個峰的IC50值見表2,峰3的IC50值最低,抑制活性最強,相比Sephadex G-15分離得到的G2的IC50值有明顯提高,反向高效液相色譜分離能達到較好的分離效果。進一步收集峰3進行質譜分析鑒定氨基酸序列結構。

表2 半制備分離純化F2后各組分峰IC50值Table 2 The IC50 of components F2 separated by semi-preparing RP-HPLC

2.6 ACE抑制肽氨基酸序列鑒定

經過分析鑒定,峰3的多肽序列為GPSGPPGP,分子量為665.32,IC50值為153.31 μmol/L,來源于金槍魚皮膠原蛋白α1肽鏈第842～849的位置,具有典型三螺旋G-X-Y結構特點,該序列目前尚未見報到。

圖6 峰3活性肽序列分析二級圖譜Fig.6 The secondary sequence profile of the purified peak3

根據ACE抑制肽的構效特點,多肽C末端三位中任一位置為Pro時,多肽具有降血壓活性[25],賈俊強[26]通過收集整理270種不同序列的降血壓肽,指出甘氨酸(Gly)在N端出現的頻率達到8%,Pro在C端出現的頻率最高為23%,Mizuno[27]指出ACE抑制活性高的多肽具有X-Pro或X-Pro-Pro的結構特征。本試驗分離純化的多肽N端氨基酸為G,C端氨基酸為P,含有三組GP結構,符合降血壓肽的構效特點。

3 結論

超聲預處理的金槍魚皮酶解液經模擬消化后,小分子多肽含量達到90%以上，且均保持較高的ACE抑制活性,說明金槍魚皮具有良好的胃腸消化抗性,可用于口服降壓藥的開發利用。超聲預處理20 min和40 min的酶解液消化產物的ACE抑制活性顯著高于其他組(p<0.05),說明超聲預處理利于酶解液在體內發揮ACE抑制活性功效,可以用于金槍魚皮膠原ACE抑制肽的高效制備。

超聲20 min酶解5 min樣品經過Sephadex G-15,RP-HPLC分離出高ACE抑制活性多肽,最后通過質譜法測得序列為GPSGPPGP,分子量大小為665.32 Da,IC50值為153.31 μmol/L,來源于α1肽鏈第842～849的位置,具有典型的三螺旋結構特點,符合高ACE抑制活性多肽的構效特點,目前尚無該氨基酸序列的報道。