分子生物學技術在釀酒微生物研究中的應用

文/南博，華潤雪花啤酒（中國）有限公司天津分公司

1 與微生物群系研究相關的分子生物學技術

1.1 核酸探針雜交技術

核酸探針雜交技術是根據待檢測微生物的特異性核苷酸序列合成核酸探針，在特定條件下與微生物核酸進行雜交，再用光密度測定法直接比較核酸雜交所得到的陽性條帶或斑點得出定量的結果，從而反映出相關微生物的存在及功能。

該方法具有快速、靈敏的特點。標記核苷酸探針可直接用來探測溶液中、固定在膜上、細胞或組織內的同源核酸序列。探針可以是長探針（100bp～1000bp），也可以是短的寡核苷酸（10～50bp）。雜交方式可以是菌落雜交、夾縫雜交或原位雜交。

1.2 PCR技術

PCR是一種體外擴增核酸序列從而得到多個核酸拷貝的技術。根據擴增的模板，引物序列來源及反應條件的不同可將PCR技術分為以下幾種:1)反轉錄PCR技術(RT-PCR)，是在mRNA反轉錄之后進行的PCR擴增，可以用來分析不同生長時期的mRNA表達狀態的相關性。2)競爭PCR(C-PCR)，是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。競爭性PCR曾被用來測定受多環芳烴污染的沉降物中的編碼鄰基二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因濃度。3)擴增的rDNA限制酶切分析技術(ARDRA)，是美國最新發展起來的一項現代生物鑒定技術，它根據原核生物rDNA序列的保守性將擴增的rDNA片段進行酶切。然后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性。

1.3 SYBR GREEN熒光檢測技術

在PCR反應體系中，加入過量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈，發射熒光信號。而不摻入鏈中的SYB R染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加隨PC R產物的增加而增加而檢測PCR產物，而且可以定量。

1.4 電泳分離及顯示技術

除我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE分離)銀染的方法外，還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記。如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)，單鏈構象多態性(SSCP)等，都是通過實施一些變性條件改變DNA雙螺旋結構(如添加線性梯度的變性劑或建立變性溫度梯度等)，由于序列不同的DNA片段，其部分解鏈程度也不同，不同的結構對DNA 在凝膠中遷移速率影響很大，結果不同序列的DNA片段在凝膠上得以高分辨率的分離。PCR-變性梯度凝膠電泳與PCR-溫度梯度凝膠電泳是根據核酸堿基序列中GC含量不同，其Tm值也不同的原理設計的。

PCR-DGGE是在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺或尿素形成從正極到負極遞增的變性劑梯度。先用特定引物PCR 增幅相同長度的目的核酸片斷，電泳時核酸片段的GC含量不同，變性的位置也不同，GC含量低的先變性，含量高的后變性，由于核酸變性后遷移阻力急劇增大，遷移速度十分緩慢，從而把GC含量不同的核酸分離開來。而PCR-TGGE則是從正極到負極形成一個遞增溫度梯度，GC含量低的先變性，含量高的后變性，從而把GC含量不同的核酸分離開來。

2 分子生物學技術在釀酒微生物群系研究中的應用

2.1 PCR技術用于釀酒微生物鑒定

伴隨著生物技術進步，利用分子生物學技術鑒定技術鑒定菌種的方法已經逐漸取代了依靠形態和生理生化特征的鑒定方法。四川大學胡承教授采用18SrDNA序列分析方法，驗證常規鑒定結果的準確性，得出在四川某名酒廠窖池中酵母主要以漢遜酵母、酒香酵母、固囊酵母、卵抱酵母、德克酵母和管囊酵母為主。張磊等應用18Sr DNA序列分析與常規分類方法相結合的方式，對濃香型大曲中主要酵母菌進行分類鑒定。

2.2 PCR-DGGE技術用于釀酒微生物的監測

白酒釀造過程是一個動態過程，窖池微生物、糟醅微生物與曲藥微生物之間的協調作用，直接影響著酒體的最終品質，所以對白酒釀造過程中的微生物檢測顯得尤其重要。四川大學張文學教授利用PCR-DGGE技術對四川某名酒廠的濃香型白酒窖池發酵過程中，中層糟醅的細菌和真菌微生物群落的演變過程進行了考察。發現入窖時，細菌和真菌都有較高的多樣性；隨著發酵過程的延伸，細菌的多樣性不斷降低，發酵一周以后，則只有一種主體細菌存在；而真菌在發酵第一周發生了主體菌的更替，發酵4周以后則一直是一類GC含量差異很小的真菌占主體。

江南大學生物工程學院采用PCR-DGGE技術，動態檢測、比較了濃香型和芝麻香型白酒酒醅在窖池發酵過程中細菌菌群結構的變化過程，并通過構建16SrRNA基因克隆文庫，分析、鑒定酒醅中含有的微生物類群。

2.3 PCR-DGGE技術用于釀酒微生物群系多樣性研究

白酒釀造環境及工藝孕育了大批寶貴而豐富的釀酒微生物資源，這些微生物通過自身的生長繁衍、交替演繹形成了其特殊而復雜的代謝網絡和豐富的酶系，使之成為釀造優質白酒的無法復制的核心。因此研究白酒釀造過程中微生物的多樣性及其消長規律對釀酒行業具有劃時代的意義。孟鎮等應用PCR-DGGE技術對濃香型白酒大曲細菌群落結構進行了系統研究；羅惠波等應用PCR-SSCP技術對濃香型白酒大曲真菌群落進行了解析；貴州大學胡萍教授利用鑲嵌式PCR-DGGE免培養技術對醬香型白酒制曲過程中微生物菌落組成及其動態變化進行了研究，得出醬香型大曲間的細菌組成存在明顯差異，母曲與出倉曲的相似性系數僅為0.29，隨著曲藥的發酵，細菌多樣性下降，優勢菌群變化明顯。

3 結束語

綜上所述，加強對分子生物學技術在釀酒微生物中應用的研究分析，對于其良好實踐效果的取得有著十分重要的意義，因此在今后的分子生物學技術應用過程中，應該加強對其關鍵環節與重點要素的重視程度，并注重其具體實施措施與方法的科學性。

【參考文獻】

[1]王海燕，張曉君，徐巖，等.濃香型和芝麻香型白酒糟醅中微生物的研究[J].釀酒科技.2017（11）：60-62.

[2]羅惠波，黃治國，李浩，等.濃香型白酒大曲真菌群落的PC R-SSCP解析[J].中國釀造.2016（21）：88-89.