生/制何首烏HPLC指紋圖譜結合模式識別與含量測定的質量控制研究

林艷 劉月新 李春 肖榕 吳萍 張智敏 林麗美 廖端芳

摘要：目的 建立不同產地生/制何首烏的指紋圖譜，結合模式識別與含量測定對其進行質量評價和鑒別。方法 采用HPLC對20批生/制何首烏進行檢測，建立何首烏HPLC指紋圖譜，運用相似度分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析對其進行評價，尋找生/制何首烏分類的主要貢獻峰，并對主要差異性化學成分進行含量測定。結果 建立了生/制何首烏的HPLC指紋圖譜，標定了10個共有峰，其中4個峰分別被指認為沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚，相似度在0.863～0.991之間；通過主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析基本能區分生、制何首烏，并確定二苯乙烯苷和大黃素為生、制何首烏的主要差異性化學成分；生、制何首烏中二苯乙烯苷的含量分別為19.30～37.72 mg/g、7.50～18.26 mg/g，大黃素的含量分別為0.53～1.67 mg/g、0.11～0.50 mg/g。結論 指紋圖譜結合模式識別與含量測定不僅可以實現何首烏質量整體信息的控制，而且能有效區分生、制何首烏。

關鍵詞：何首烏；指紋圖譜；二苯乙烯苷；大黃素；模式識別

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.016

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0062-05

Abstract： Objective To establish fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. from different producing areas； To identify and evaluate its quality by combining with pattern recognition and content determination. Methods HPLC was used to detect 20 batches of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and HPLC fingerprints of Polygonum multiflorum Thunb. were established. Similarity analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discrimination analysis were used to evaluate and find the main contribution peaks leading to the classification of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and content determination of main different chemical components was conducted. Results HPLC fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were established， and 10 common peaks were marked， 4 of which were referred to as gallic acid， stilbene， emodin and emodin methyl ether， respectively， with similarities between 0.863 and 0.991. Principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis could basically separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and stilbene and emodin were determined as the main different chemical components between crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.. The contents of stilbene in crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were 19.30–37.72 mg/g and 7.50–18.26 mg/g， respectively， and the contents of emodin were 0.53–1.67 mg/g and 0.11–0.50 mg/g， respectively. Conclusion Fingerprints combined with pattern recognition and content determination can not only realize the control of quality overall information of Polygonum multiflorum Thunb.， but also effectively separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.

Keywords： Polygonum multiflorum Thunb.； fingerprints； stilbene； emodin； pattern recognition

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根。生何首烏苦泄性平兼發散，具有解毒消癰、潤腸通便、截瘧功效；制何首烏味甘厚性溫，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨的作用[1]。現代研究表明，何首烏中主要含有二苯乙烯苷、蒽醌及鞣質等活性成分[2-3]。何首烏受產地、生長年限、采收時間、炮制加工、貯存等因素影響，其化學成分及質量存在一定的差異。

指紋圖譜結合模式識別方法已被應用于藥物的質量控制、差異標記物的篩選等方面[4-5]。何首烏藥材指紋圖譜目前已有文獻報道，但僅涉及建立HPLC指紋圖譜，或分析二苯乙烯苷含量與生/制何首烏分類及質量控制的關系[6-12]。因此，本研究建立生/制何首烏指紋圖譜并對其進行模式識別，尋找導致生/制何首烏差別的主要貢獻化合物，并對主要差異性化學成分進行含量測定，為何首烏質量整體控制及生/制何首烏的鑒別提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜系統（PDA檢測器），安捷倫科技有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CP114電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；0.22 ?m微孔濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司；RT-04A型高速粉碎機，香港泓荃制藥機械公司。

沒食子酸對照品（批號YA0505YA14，純度≥98%）、大黃素對照品（批號P02N6F299，純度≥98%）、大黃素甲醚對照品（批號P21S6F3673，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；二苯乙烯苷對照品（批號N1103AS，純度≥98%），大連美侖生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。20批何首烏飲片購于其產地各省大藥房和市場，所有樣品均經湖南中醫藥大學藥學院中藥鑒定學教研室龔力民副教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Epic-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇（B）-水溶液（D），梯度洗脫（0～12 min，10%～40%B；12～20 min，40%～60%B；20～27min，60%～90%B；27～30min，90%～100%B；30～40min，100%B）；流速：1 mL/min；檢測波長：264 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 4種化學成分對照品溶液的制備

分別取沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚濃度分別為0.34、3.68、0.36、0.91 mg/mL混合對照品溶液，用于指紋色譜峰確認。

2.2.2 2種化學成分對照品溶液的制備

分別取二苯乙烯苷、大黃素對照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對照品貯備液；取一定量對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋，得到二苯乙烯苷濃度分別為0.046、0.092、0.184、0.368、0.736、1.472 g/L，大黃素濃度分別為0.001 8、0.003 6、0.007 2、0.014 4、0.028 8、0.057 6 g/L的混合對照品溶液，用于含量測定。

2.2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過4號篩）約0.3 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入60%甲醇，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 ?m微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，以第1次進樣所得指紋圖譜作為對照圖譜計算相似度，其相似度均大于0.99，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，以0 h所得指紋圖譜為對照，各指紋圖譜相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗

取同一批樣品粉末（S9），按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進行指紋圖譜測定，其指紋圖譜相似度均大于0.97，表明本方法重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及分析

按“2.2.3”項下方法制備20批何首烏供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采集40 min色譜圖，剔除因流動相梯度變化而出現的不規則色譜峰，選擇峰面積最大、出峰時間最穩定的5號峰為作為參照峰，分別計算其他共有峰相對峰面積，結果見表2。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2010版）》進行數據處理，生成何首烏指紋圖譜。根據20批樣品測定結果，標定了10個共有峰，指認了3、5、9、10號4個色譜峰，分別為沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚。結果見圖1。

2.3.5 何首烏相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2010版）》對20批何首烏指紋圖譜進行相似度分析，結果20批樣品的相似度分別為0.884、0.996、0.975、0.984、0.990、0.970、0.982、0.970、0.985、0.986、0.971、0.983、0.988、0.985、0.957、0.976、0.983、0.863、0.962、0.991，均大于0.85，具有良好的相似度，表明不同批次的何首烏化學成分組成基本一致，質量穩定。但不同批次各色譜峰的峰面積存在差異，說明各化學成分含量具有一定的差異。

2.4 化學模式識別

2.4.1 主成分分析

采用主成分分析（PCA）對20批何首烏樣品建模，以共有峰峰面積為自變量（以出峰時間標記峰的歸屬），以不同批次何首烏為因變量（Y），將數據導入Simca13.0軟件進行分析，從PCA得分圖可見，20批何首烏大致可分為2類，見圖2。

2.4.2 正交偏最小二乘法-判別分析

運用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）建立生/制何首烏HPLC指紋圖譜差異模型。結果表明，該方法能夠很好地將生/制何首烏分成2類，見圖3。根據VIP>1.5、P<0.05的變量來篩選導致差異性的主要化學成分，發現5號峰二苯乙烯苷（Rt=19.228）和9號峰大黃素（Rt=33.018）為生/制何首烏最主要的差異性化學成分，見圖4。

2.5 特征成分含量測定

2.5.1 線性關系考察

取一定量對照品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，記錄相應峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算。結果二苯乙烯苷回歸方程為Y=3083.2X-34.1，r=0.999 0，在0.23～7.36 ng范圍內線性關系良好；大黃素回歸方程為Y=17 103X-12.46，r=0.999 2，在0.009～0.288 ng范圍內線性關系良好。

2.5.2 加樣回收率試驗

取同一批樣品粉末（S9）6份，每份0.15 g，精密稱定，按相當于樣品中二苯乙烯苷、大黃素測定量100%加入相應對照品，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進行含量測定，計算加樣回收率，結果見表3。

2.5.3 樣品含量測定

分別取20批何首烏樣品粉末，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進行含量測定，計算樣品中二苯乙烯苷和大黃素含量，結果見圖5、圖6。20批樣品中，二苯乙烯苷在生何首烏中含量為19.30～37.72 mg/g（1.9%～3.8%），在制何首烏中含量為7.50～18.26 mg/g（0.7%～1.8%）。2015年版《中華人民共和國藥典》規定，二苯乙烯苷在生何首烏中含量不得低于1.0%，在制何首烏中含量不得低于0.7%。據此判斷，20批樣品均為合格品，與指紋圖譜相似度分析結果一致。此外，由于生何首烏中二苯乙烯苷的含量在1.9%以上，而制何首烏中二苯乙烯苷的含量在1.9%以下，據此可以區分生、制何首烏。20批樣品中，大黃素在生何首烏中含量為0.53～1.67 mg/g（0.05%～0.17%），在制何首烏中含量為0.11～0.50 mg/g（0.01%～0.05%），可見，生何首烏中大黃素含量在0.05%以上，制何首烏中大黃素含量在0.05%以下，據此也可區分生、制何首烏。上述二苯乙烯苷和大黃素含量測定結果與指紋圖譜模式識別結果一致，兩者可相互驗證。

圖5 20批何首烏中二苯乙烯苷和大黃素含量測定結果

3 討論

本試驗對樣品提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取時間（15、30、45 min）、流動相（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.05%甲酸）、波長（280、235、264 nm）、色譜柱（Agilent Zorbax Sb-C18，Agilent Eclipse Xdb-C18，Epic-C18）進行了詳細考察，確定了樣品處理方法和色譜條件，在此條件下色譜峰較多，分離效果較好。

本試驗建立了生/制何首烏HPLC指紋圖譜，標定了10個共有峰，指認了其中4個色譜峰。通過模式識別分析方法，建立了生/制何首烏的分類模型，并確定二苯乙烯苷和大黃素是生/制何首烏中最主要的差異性化學成分。另外，也可根據何首烏中二苯乙烯苷和大黃素的含量測定結果區分生/制何首烏。本試驗建立的指紋圖譜和含量測定方法，不僅能體現何首烏的整體質量，也可有效區分生、制何首烏，為何首烏的質量控制提供參考。

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