動物源性食品中β-受體興奮劑類多殘留檢測方法研究

◎ 譚 策，趙 琪，甄 珍，譚陽陽

（1.齊齊哈爾海關(guān)，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.牡丹江海關(guān)，黑龍江 牡丹江 157000）

本文通過對QuEChERS方法進行改進研究，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，形成快速的動物組織中β-受體興奮劑類藥物殘留定量定性檢測方法。對現(xiàn)有動物源性食品組織樣品的前處理方法進行條件優(yōu)化，并建立新的簡單、凈化效果良好、靈敏度高且能滿足日常的檢測需要的檢測方法。克服目前β-受體興奮劑類藥物殘留分析方法的不足。

1 QuEChERS方法應(yīng)用前處理

1.1 材料和方法

1.1.1 主要試劑和材料

主要試劑和材料見表1。

表1 主要試劑和材料表

①1 mol/L乙酸銨溶液。稱取19.27 g乙酸銨。用水溶解定容至250 mL。②5 mmol/L乙酸銨溶液。將5 mL 1 mol/L乙酸銨溶液溶解于1L超純水中。③4%氨水-乙酸乙酯溶液。量取20 mL氨水于500 mL乙酸乙酯中，搖勻。④5%甲酸-乙腈溶液。量取5 mL甲酸加入95 mL乙腈中。

1.1.2 主要標準品

主要標準品見表2。

表2 主要標準品表

（1）標準儲備液的配制。分別吸取克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅標準品1 mL于25 mL儲液瓶中，用甲醇溶解，定容到10mL。得到10 μg/mL的標準品儲備液。保存在-20 ℃冰箱里，有效期為6個月。

（2）標準中間液的配制。分別吸取克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅標準儲備液1 mL于25 mL儲液瓶中，用甲醇∶水=9∶1的溶液進行稀釋，定容至10 mL，得到1 μg/mL混合標準中間液。4 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。

1.1.3 主要設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：型號Thermo TSQ Quantum Access MAX，美國熱電公司；天平：感量0.01 g，瑞士梅特勒公司；組織勻漿機：型號IKAT25。高速離心機：型號L-550，湘儀牌；渦旋混勻器：型號IKAMS3；電熱恒溫水浴鍋；pH測定儀：型號FE28-Standard，品牌瑞士梅特勒托利多；電熱干燥箱：型號OGS100，品牌賽默飛世爾；固相萃取裝置：型號Supelco，12孔。

1.1.4 樣品來源與準備

分別在前往農(nóng)貿(mào)市場、大福源超市購買牛肌肉、牛肝臟、豬肌肉以及豬肝臟，利用粉碎機對牛肌肉、牛肝臟、豬肌肉以及豬肝臟進行絞碎，對樣品進行均質(zhì)攪拌，確保樣品均勻。經(jīng)過處理的樣品塑封包裝好后放入冰箱冷鮮層備用。

1.2 方法建立

1.2.1 測定步驟

稱取粉碎均勻的動物源性組織（2±0.1）g，加入到50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5%甲酸乙腈10 mL，立即用渦旋振蕩器混合2 min，在5 000 r/min下離心5 min備用，將5 mL乙酸銨緩沖液（5 mmol/L）加入到15 mL EMR-lipid dSPE凈化管中，從離心管中移取5 mL上清液加入到已經(jīng)活化好的EMR-lipid凈化管中凈化，立即使用渦旋振蕩器混合2 min，在5 000 r/min下離心3 min，取離心后上清液5 mL加入到含有2 g（NaCl與MgSO4的比例為1∶4）鹽的15 mL EMR-Lipid Polish反萃管中，并渦旋混合1 min，在5 000 r/min下離心3 min，取上清液1 mL在45 ℃氮吹儀下吹至近干，用甲醇+0.1%甲酸水溶液（10+90，V/V）1 mL定容，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測。

1.2.2 方法優(yōu)化

現(xiàn)有的前處理步驟常采用乙腈和水混合液進行提取，然后利用SPE小柱或其他凈化技術(shù)進行凈化。SPE小柱去除動物源性樣品中雜質(zhì)的能力有限，而且在稀釋或復(fù)溶過程中易出現(xiàn)沉淀。如果有沉淀則要在裝入進樣小瓶之前對溶液進行過濾，分析物可能造成損失。有研究證明在固相萃取（dSPE）過程中可以加入正己烷等溶劑去除提取液中的脂肪等雜質(zhì)，但這種方式具體實施步驟繁瑣，而且沒有特異性，疏水性分析物也會被去除。傳統(tǒng)SPE填料常常為C18，與其相比使用氧化鋁填料的方式能夠提高凈化效果，但是會導致大量分析物流失。如果測定的化合物中含有羧酸和羥基的話，流失更會嚴重。現(xiàn)今QuEChERS方法很好地解決了上述問題。不過這種方法的缺點是樣品前處理過于簡單，造成部分脂肪去除效果不好。部分脂肪將與目標分析物一起保留到最終定溶液中。造成色譜分離難度加大、質(zhì)譜確證不準確和靈敏度下降以及質(zhì)譜清洗頻繁等問題。脂肪的干擾是QuEChERS方法干擾重點，因此去除它對于方法的進展來說非常重要。Agilent QuEChERS類的增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品是一種新型吸附劑材料。很好地彌補了QuEChERS方法對動物源性獸藥多殘留檢測時的缺點。

同時，實驗過程中比較了傳統(tǒng)SPE C18填料、氧化鋁填料吸附劑、Agilent QuEChERS類的增強型脂質(zhì)去除填料與空白基質(zhì)去除能力的比較。實驗方式為基質(zhì)中加入相同濃度的標準溶液后，通過凈化對比不同的響應(yīng)差異。得到結(jié)果表明，選用增強型脂質(zhì)去除填料的方法，脂肪去除率最好，標準品信噪比最高。

1.2.3 質(zhì)譜的優(yōu)化

通過對β-受體興奮劑類藥物的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析得出，離子源選擇ESI源正離子模式。使用清洗過的注射泵吸取一定量濃度約10 μg/mLβ-受體興奮劑類標準中間液，連接到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，流動相選擇和進樣相同的比例和溶劑。全掃描，找到母離子。在監(jiān)視窗顯示得到目標母離子強度超過e7以上時，確定每種β-興奮劑類藥物的分子離子。然后利用軟件對母離子進行自動二級質(zhì)譜全掃描，選擇5個信號大的子離子。最后選擇信號強度較大的兩個碎片離子為特征子離子，并優(yōu)化得到每種β-興奮劑類藥物的母離子和子離子所需的最佳錐孔電壓和碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進行掃描。在正離子模式下的目標物母離子強度必須在e7左右，確保MS/MS狀態(tài)下自動篩選子離子結(jié)果更好，離子強度達不到要求的情況下，可以增大標準品溶液濃度或加快注射泵速度。主要需要優(yōu)化的參數(shù)有Tube Lens Offset、鞘氣、輔助氣和Skimmer Offset。得到最優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表3。標準品子離子掃描色譜圖見圖1。

表3 優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)表

圖1 β-受體興奮劑類標準品定量離子色譜圖

2 結(jié)論

本研究優(yōu)化了傳統(tǒng)酶解前處理方法，建立了牛和豬的肌肉、肝臟中4種主要β-受體興奮劑的多殘留檢測方法。采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶水解，堿化乙酸乙酯提取，SPE柱凈化。采用堿化乙酸乙酯作為新的提取方法，回收率平均提高了8.5個百分點（見表4），并且干擾雜質(zhì)很少，前處理過程簡單，其靈敏度大幅度優(yōu)于傳統(tǒng)方法（見表5）。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選擇MRM模式，同時進行定量和確證，該方法靈敏度高、能滿足檢測需要。試驗中選擇了母離子以及對應(yīng)產(chǎn)生的兩個響應(yīng)較強的子離子作為定性定量的依據(jù)，完全滿足國內(nèi)及歐盟對確證方法的要求。

表4 優(yōu)化前后回收率比較表

表5 優(yōu)化前后檢出限比較表

通過對QuEChERS方法進行改進研究和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，最后形成對β-受體興奮劑類藥物在動物組織中的殘留的定量定性快速檢測方法。與國家標準方法和文獻報道方法相比，QuEChERS方法檢測β-受體興奮劑類時的前處理用時4 h，而酶解法前處理用時16 h，可見，QuEChERS方法的用時短、成本低，同時回收率保證在70%～75%，檢出限在0.5 μg/kg以下，此方法可以成為快速、可靠與穩(wěn)定的前處理方法。

本研究通過完善和建立不同的前處理方法，使得β-受體興奮劑類藥物在動物組織中殘留的檢測變得更加快捷和準確。研究的成功將為保證動物源性食品安全提供一項重要的技術(shù)支持，對規(guī)范養(yǎng)殖行業(yè)，保障人民生活健康，解決國內(nèi)外貿(mào)易糾紛起到積極作用，為仲裁或政府監(jiān)督、檢查提供科學依據(jù)。