超聲輔助表面活性劑提取咖啡生豆中綠原酸

◎ 唐 薇，孫飛龍，曹卓松，楊 柳，寧景葉

（西安工程大學環境與化學工程學院，陜西 西安 710048）

綠原酸是綠咖啡豆（又常稱生咖啡豆）的主要生物活性成分之一，是由咖啡酸與奎尼酸合成的一種苯丙素類物質，易溶于水、醇和丙酮等溶劑[1]，具有抗氧化性、抗菌等生物活性，應用于食品、藥品和日化等多個領域[2-3]。目前，從杜仲和金銀花中提取綠原酸常采用水或醇來浸提，耗材、耗時且提取率偏低，且利用表面活性劑提取綠原酸的研究甚少，所以本文利用表面活性劑聚乙二醇（PEG）用量少、增溶等性質，相比傳統乙醇或者甲醇等較綠色，借助超聲波技術的空化和機械攪動作用進行提取[4-5]。本文利用超聲波提取法，從5種不同性質溶劑中對比優選出最佳提取劑及其濃度，并通過固液比、提取溫度、提取時間進行單因素和響應面BBD法優選提取最佳工藝，本課題對咖啡生豆中綠原酸的開發利用具有一定的研究價值和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

云南A級卡蒂姆咖啡生豆，綠原酸標準品，SK5200LH超聲波清洗儀，722型可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程

咖啡生豆烘干、粉碎、過篩→咖啡粉→PEG400超聲提取→粗提液。

1.2.2 綠原酸標準曲線的制作

稱取5 mg綠原酸標準品溶解于1 mL的95%乙醇中，再用95%乙醇定容至100 mL，配成0.05 mg/mL工作液備用。吸取1、2、3、4 mL和5 mL工作液用95%乙醇定容至10 mL，用95%乙醇做對照，于328 nm處測吸光度。實驗重復3次，以綠原酸濃度為橫坐標，平均吸光度值為縱坐標，得到一元線性回歸方程y＝0.036 5x-0.006，R2＝0.999 8．其中，x為綠原酸標準溶液質量濃度（μg/mL）；y為綠原酸標準溶液吸光值。

1.2.3 提取液中綠原酸含量的測定

從待測液中移取1 mL用95%乙醇稀釋后定容至10 mL，于328 nm處測吸光度，按式（1）計算綠原酸得率Y。

式（1）中，c為由標準曲線得出的綠原酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數；v為配成溶液的體積，mL；m為咖啡粉的質量，g。

1.2.4 提取劑及其濃度的優選

精密稱取1 g咖啡粉末于茄形瓶中，分別以20%、40%、60%、80% 4個不同濃度的甲醇、乙醇、PEG200、PEG400、PEG600為提取劑，在超聲波清洗儀中以液固比（mL/g）30∶1，溫度65 ℃，時間50 min條件下超聲提取，測抽濾后濾液的吸光度，平行實驗3組，計算綠原酸平均得率。

1.2.5 單因素實驗

按一定液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1）與40% PEG400混勻，在不同提取溫度下（50、55、60、65、70 ℃和75 ℃）超聲提取一定時間（20、30、40、50、60 min和70 min），靜置冷卻后抽濾，于328 nm處測濾液吸光度，計算綠原酸得率，分析不同因素的影響。

1.2.6 響應面實驗

根據單因素實驗對液固比、提取溫度、提取時間進行3因素3水平響應面分析，根據Box-Behnken Design（BBD）設計響應面實驗，見表1。分析綠原酸在不同提取條件下的含量，從而優化最佳提取條件。

表1 中心組合Box-Behnken因素水平表

1.2.7 實驗驗證

按照Design-Expert軟件中的Box-Behnken Design（BBD）模型優化后所得的提取條件,做3組平行實驗，并計算得率。

2 結果與分析

2.1 提取劑及其濃度的選擇

由圖1可得，5種提取劑相比PEG400提取率最大，隨著濃度增大，提取率先增大后減小，可能是由于黏度增大，極性減弱，不利于提取傳質和溶質溶出。PEG400濃度為40%時最高，因此選40%的PEG400為最佳提取濃度和提取劑。

圖1 不同提取劑對綠原酸得率的影響圖

2.2 單因素實驗

由單因素實驗得下圖2，65 ℃條件下，提取50 min，隨著液固比增大得率增大到30:1時最大，之后緩慢下降，這可能由于綠原酸大部分已溶出，再增加溶劑，其他物質競爭增容位置，導致得率下降，因此液固比選擇30∶1較為合適；液固比30∶1，65 ℃條件下，時間越久，得率先緩慢增加，在50 min時得率最大，之后迅速下降，原因可能是時間越久，超聲波剪切作用更透徹，破壞了綠原酸分子結構，也或者其他溶質物質析出，影響了綠原酸吸光度的測定，因此提取50 min時得率最大；液固比30∶1條件下，提取50 min，期間，可能由于溫度較高破壞了綠原酸的結構造成得率先升后降，因此60 ℃提取得率最大。

2.3 響應面實驗

2.3.1 數學模型的建立

根據Design-Expert8.0.6設計3因素3水平實驗得到二次回歸方程：Y=13.45-1.13A-0.083B-0.029C+0.14AB-0.17AC+0.41BC-1.33A2-0.71B2-0.45C2，

R2=0.9882，RAdj2=0.9371，CV=1.59%＜5%，說明模型擬合度和穩定性好。方差分析見表2。

表2 回歸方程方差分析表

從表2得，模型P值＜0.000 1，則實驗所選的二次多項式模型在95%水平上有高度顯著性；失擬值P為0.800 8＞0.05，表示在95%水平上失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，即模型準確可靠，方程擬合良好。表中A、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，因此，固液比的一次項，溫度和時間的交互項，固液比、時間和溫度的二次項對咖啡生豆中綠原酸的提取在統計學上有顯著性大的影響。在所選因素水平范圍內，影響綠原酸得率的因素順序是A＞B＞C。

2.3.2 響應面3D Surface

響應面3D Surface直觀反應各因素交互作用對綠原酸得率的影響，曲面坡度越大，等高線越呈現橢圓形且越密，說明交互作用影響越大，由圖2可知，液固比對得率影響最大，溫度和時間次之，所選時間影響最小，這與方差分析結果相吻合。

圖2 各因素交互作用對綠原酸得率的影響圖

2.3.3 驗證試驗

根據二次多項式解得最佳工藝條件（修正后）：液固比28∶1，溫度60 ℃，時間50 min，咖啡生豆中綠原酸的得率是13.698 6 mg/g。平行3組實驗得到平均得率為13.68 mg/g，這與模型給出的預測值基本一致。

3 討論與結論

本實驗目的在于采用綠色途徑高效優化提取咖啡生豆中綠原酸的提取工藝，綠原酸廣泛應用于食品和醫藥中，因此綠色提取工藝尤為重要。本文將常用提取劑甲醇、乙醇和不同分子量的表面活性劑PEG進行對比同時優選了提取劑的濃度，比較綠原酸的得率，通過單因素和響應面相結合，得到超聲波輔助提取綠咖啡豆中綠原酸最佳工藝條件：40% PEG400為提取劑，液固比28∶1，溫度60 ℃，時間50 min，得到得率為13.68 mg/g，由響應面分析得影響得率的因素順序：液固比＞溫度＞時間。該提取工藝操作簡單，能耗少，得率高，為提取綠原酸提供一定參考價值。