一例肉牛病毒性腹瀉診斷與治療

杜文炳，冉龍文，張宇，陳凱，楊科花

（江蘇省常州市武進區動物檢疫站，常州 213165）

0 引言

牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的一種以水樣腹瀉為主要特征，同時伴隨繁殖障礙以及免疫機能障礙為主要特征的一種急性高度接觸性傳染病[1]。BVD感染可造成免疫抑制和持續性感染，造成機體免疫力低下，極易誘發其他病原的混合感染或者二次感染，是目前影響肉牛養殖的重要疫病之一[2]。廣大群眾對于牛肉的需求日益增加，肉牛養殖發展迅速。但是由于缺乏相應的管理經驗與疫病防控方法，肉牛場BVDV感染引起的腹瀉及相關疾病時有發生，嚴重影響養殖戶的經濟效益。結合一例典型的BVDV病例，探討BVDV發病的癥狀以及治療要點，同時對BVDV E0蛋白進行進化分析，為我國BVDV防控以及疫苗研發提供參考數據。

1 病例簡介

2018年初春，某肉牛養殖場發生頑固性腹瀉，病程3～5 d不等。發病早期主要表現為全身癥狀，病畜精神高度萎靡、食欲不振，有的甚至廢絕；大部分病牛表現水樣腹瀉，呈噴射狀，個別糞便中夾雜血液或黏膜組織碎片，漸進性消瘦，部分鼻鏡有潰爛面，反芻停止，體溫在40 ℃左右。牛場技術人員先期進行抗生素治療，但是效果不佳，且患畜日益增加。根據臨床癥狀和治療情況分析，初步診斷為牛病毒性腹瀉感染。采集患畜的糞便進行實驗室RT-PCR檢測。

2 RT-PCR檢測

將采集到的BVDV疑似病料用無菌PBS進行1∶3稀釋，13 000 rpm離心2 min，取上清使用Trizol進行常規RNA提取，反轉錄生成cDNA后使用L1：5ˊ-GGTGTGGAGGAACCTGTTTATGATCAG-3ˊ，L2：5ˊ-CCTTTACTATTACCCGACCTGCAGTCACCTC-3ˊ引物進行PCR檢測檢測。PCR反應體系如下：12.5 μLMix聚合酶，L1和L2引物各1 μL，cDNA 3 μL，無菌雙蒸水補足25 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min后，94 ℃變形30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。PCR產物預期大小為498 bp。PCR循環結束后取5 μL產物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（見圖1）。M為DL 2 000 marker，1號泳道為待檢病料，2號泳道為陽性對照。在1號泳道出現預期大小的條帶，與2號泳道的條帶大小一致，判斷待檢病料為BVDV陽性。

圖1 BVDV的PCR檢測

3 BVDV E0基因的擴增與分析

采取馬文瑞等設計的引物對BVDV E0基因進行擴增。PCR反應體系同2，PCR反應條件為95 ℃預變性5 min后，94 ℃變形30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR循環結束后取5 μL產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。如圖2所示，M為DL2 000 marker，1、2泳道為E0基因擴增結果。將目的片段回收，使用寶生物公司的膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD18-T載體，轉化JM109感受態細胞于添加有氨芐抗生素的平皿，37 ℃溫箱培養12 h，挑取白斑于添加有氨芐抗生素的液體LB培養基中進行培養，送上海生工生物工程有限公司進行序列測定。研究得到的毒株命名為CH-HENAN。以上所述試驗耗材均為寶生物工程大連有限公司產品。M 1 2

圖2 BVDV E0基因的擴增

將測序的結果使用DNA star軟件進行序列拼接，與Genbank下載的BVDV E0基因序列構建徐彤進化樹，如圖3所示，CH-HENAN株序列與BVDV亞型的KU756226株、KF835697和MG950357毒株同為BVDV-1b亞型，而與BVDV-1a亞型和BVDV-2亞型的親緣關系較遠。表明目前河南范圍內流行的毒株以BVDV-1b亞型為主。

圖3 BVDV 系統進化分析

4 討論與結論

腹瀉是影響肉牛生長的重要疫病。由于細菌性腹瀉和病毒性腹瀉在臨床表現十分相似，無法用肉眼進行區分，因此對于疫病的確診，特別是病毒性腹瀉的確診必須借助實驗室診斷方法，以區分牛冠狀病毒、牛輪狀病毒以及牛病毒性腹瀉病毒等病原，進而采取相應的治療措施。與傳統的病毒中和試驗和間接免疫熒光方法相比，研究采用的RT-PCR檢測方法在分子水平對病原進行鑒定，具有快速、準確等優點。結果與臨床癥狀相互印證，在很大程度上挽回養養殖戶的損失。因此，在肉牛飼養中，如果出現頑固性腹瀉，抗生素治療無效，且疫病傳播迅速時，需要及時通知當地獸醫主管部門采用實驗室診斷方法迅速確診，以及時采取措施，及早控制疫病蔓延。

BVDV根據基因組序列的差異可以分為BVDV-1和BVDV-22個基因型，其中有型又可以分為多個亞型[3]。對BVDV基因分型研究得知地區內病毒遺傳進化情況、進化規律以及抗原位點的變化，為疫苗的研發提供有效的參考。研究選擇的E0基因是BVDV基因組主要的保護性蛋白基因，結果與近期的相關報道一致[4]。表明BVDV-1b亞型已成為我國牛群BVDV流行的優勢基因型，為后續的診斷方法的研發以及疫苗制劑的發展奠定基礎。