綠蘿花中化合物分離與抗氧化活性研究

李克新，錢 程

（中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

綠蘿花為瑞香科（Thymelaeaceae）結(jié)香屬滇結(jié)香（Edgeworthia gardneri）的干燥花蕾，是民族特色習(xí)用藥材。據(jù)《藏醫(yī)養(yǎng)生圖說(shuō)》[1]記載，綠蘿花對(duì)糖尿病、高血壓等具有良好的治療效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，綠蘿花中含有黃酮類物質(zhì)、香豆素、多糖、揮發(fā)油以及微量元素等多種化合物[2-4]。

本實(shí)驗(yàn)以綠蘿花為研究對(duì)象，對(duì)其乙酸乙酯萃取層經(jīng)反復(fù)柱色譜與循環(huán)制備液相色譜，得到5個(gè)化合物，并采用波譜學(xué)方法解析化合物的結(jié)構(gòu)，采用1，1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法（DPPH）對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，為更深入地研究和開(kāi)發(fā)綠蘿花的藥用價(jià)值及資源的充分利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

材料：薄層色譜用青島海洋化工廠分廠硅膠板，柱色譜用青島海洋化工廠分廠柱硅膠和拌樣硅膠，seph -dex LH-20，DPPH，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、丙酮等均為分析純，儀器用甲醇為色譜純，水為超純水。

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，制備型高效液相色譜儀（LC-20AP），分析型高效液相色譜儀（LC-20A），循環(huán)制備色譜儀，多功能酶標(biāo)儀（Enspire），超導(dǎo)核磁共振波譜儀（AVANCE 600MH）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物的分離與鑒定

取600 g干燥的綠蘿花藥材，以75%的乙醇溶液采用溶劑提取法加熱回流2 h，提取2次，合并濾液減壓濃縮得到綠蘿花總提取物100 g。用浸膏∶水=1∶40的比例溶解總浸膏，依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓濃縮得到綠蘿花乙酸乙酯粗提物10 g。經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯-甲醇（100∶0∶0-0∶50∶50）梯度洗脫、TLC薄層色譜合并浸膏，尋找適宜洗脫劑條件。再經(jīng)硅膠柱色譜，凝膠柱色譜，減壓硅膠柱色譜，循環(huán)制備色譜等色譜學(xué)方法分離，得到5種單體化合物。采用核磁共振氫譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

1.2.2 化合物抗氧化活性測(cè)定

采用DPPH自由基清除法測(cè)定化合物抗氧化活性。將化合物及陽(yáng)性對(duì)照維生素E配制成1 mg/mL的母液，并梯度稀釋配制成0.5 mg/mL至0.001 mg/mL的10個(gè)質(zhì)量濃度溶液，DPPH溶液質(zhì)量濃度為400 μg/mL。將樣品及維生素E溶液依濃度梯度加入96孔板中，加樣量為100 μL。再加入等體積DPPH溶液，并設(shè)置樣品溶液和DPPH溶液空白對(duì)照。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。將加液完成的96孔板置于多功能酶標(biāo)儀中，在37 ℃下選擇震蕩10 s，并在酶標(biāo)儀中靜置30 min至反應(yīng)完全，此后在517 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量，讀出吸光度值，計(jì)算清除率。

A0—DPPH溶液空白對(duì)照的吸光度測(cè)量值；A1—樣品反應(yīng)液的吸光度測(cè)量值；A2—樣品及維生素E溶液的吸光度測(cè)量值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)信息

以綠蘿花為研究對(duì)象，對(duì)乙酸乙酯粗提物經(jīng)反復(fù)柱色譜與循環(huán)制備液相色譜分離純化得到化合物。用TLC薄層色譜經(jīng)3個(gè)不同體系進(jìn)行顯色，均為單斑，證明為單體化合物。結(jié)構(gòu)信息如圖1～5所示。

圖1 tiliroside，R-H

圖2 isoquercetin

圖3 kaempferol-3-O-β-D-glucoside

圖4 quercetin

圖5 Caffeic acid

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：在1H-NMR譜圖中，顯示存在苯環(huán)上典型的AA′BB′系統(tǒng)的氫信號(hào)，6.12（1H，d，J=1.7 Hz，H-6），6.35（1H，d，J=1.7 Hz，H-8）分別為苯環(huán)上6、8位的質(zhì)子信號(hào)，可推斷化合物的苷元部分為山奈酚，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致[5]，故鑒定為銀椴苷（tiliroside）。

化合物2：1H-NMR譜圖與文獻(xiàn)中槲皮素的1H-NMR譜數(shù)據(jù)非常相近，判斷譜圖中5.24（1H，d，J=7.2Hz，H-1’’）是β-D-葡萄糖端基質(zhì)子。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致[6]，故鑒定為異槲皮素（isoquercetin）。

化合物3：1H-NMR譜中，顯示苯環(huán)上典型的AA′BB′系統(tǒng)，J=8.8 Hz，為B環(huán)上質(zhì)子耦合，提示4′位有取代。δH6.33、6.15氫信號(hào)是AB系統(tǒng)，J=2.0 Hz，為A環(huán)上間位質(zhì)子耦合，提示該化合物的苷元部分為山奈酚。δH5.19（1H，d，J＝6.0 Hz）為葡萄糖端基質(zhì)子，由其偶合常數(shù)推斷糖端基構(gòu)型為β型。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致[7]，故鑒定為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D -glucoside）。

化合物4：1H-NMR譜中，顯示B環(huán)ABX自旋耦合系統(tǒng)中的H-2’，H-6’，H-5’信號(hào)；δH6.38，δH6.17的氫信號(hào)是AB系統(tǒng)，J=2.0 Hz，為A環(huán)上間位質(zhì)子耦合，提示A環(huán)5，7位有取代。與文獻(xiàn)中[8]槲皮素基本一致，故鑒定為槲皮素（quercetin）。

化合物5：1H-NMR譜中，根據(jù)δH7.02（1H，d，J=2.0 Hz），6.76（1H，d，J=8.8 Hz），6.95（1H，dd，J=8.8，2.0 Hz）為苯環(huán)上的ABX耦合系統(tǒng)的氫信號(hào)，分別為苯環(huán)上2，5，6位上的氫信號(hào)，根據(jù)δH7.52（1H，d，J=15.6 Hz），6.21（1H，d，J=15.6 Hz）判斷苯環(huán)上接有一個(gè)反式雙鍵，與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定為咖啡酸（caffeic acid）。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)得，不同濃度的樣品溶液和維生素E溶液在37 ℃下與等體積的DPPH溶液反應(yīng)0.5 h后測(cè)得的吸光度計(jì)算抗氧化活性，得到以下結(jié)果。

與0.04 mg/mL的DPPH溶液反應(yīng)，化合物1-5抗氧化活性IC50值分別為0.011 mg/mL，0.004 mg/mL，0.012 mg/mL，0.005 mg/mL，0.021 mg/mL，VE的抗氧化活性IC50值為0.006 mg/mL，則抗氧化活性2＞4＞VE＞1＞3＞5。