利用過氧化氫酶活性鑒別藥用原料乳豬肝和成年豬肝研究

羅清榮，李雪雁，鄭澤鑫，楊 林，李 玲，謝 果

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402）

1 豬肝營養(yǎng)概述

豬肝含有豐富的鐵、磷，還富含蛋白質(zhì)、卵磷脂和微量元素，具有重要的營養(yǎng)價值。自20世紀(jì)80年代，從乳鼠和部分切除的肝組織提取出生物活性物質(zhì)以來，對于肝臟提取物中活性成分的研究一直受到廣泛關(guān)注。

目前，從豬肝臟中可以提取制備肝素、豬肝酯酶、卵磷脂、肝水解肽等生化藥劑，具有重要的藥用價值。其中促肝細胞生長素是從新鮮乳豬肝或未哺乳新生牛新鮮肝臟中提取的一種能夠促進肝細胞再生的生物活性物質(zhì)，主要用于治療各種重型病毒性肝炎、慢性肝炎等疾病。實驗表明，參考促肝細胞生長素的生產(chǎn)工藝，以乳豬肝為原料制備肝水解肽，與成年豬、牛肝臟為對照，考察產(chǎn)品活性及收率差異，結(jié)果證明乳豬肝源制品的生物活性遠高于成年豬、牛肝源制品，且含量及收率亦有所提高。

從臨床用藥的有效性考慮，以兩個月以內(nèi)的乳豬肝代替成年動物肝臟制備的肝水解肽具有較高的應(yīng)用價值，應(yīng)當(dāng)成為制藥企業(yè)的原料標(biāo)準(zhǔn)。但是，基于成本考慮，成年豬肝比乳豬肝價格低，而僅憑外觀又無法準(zhǔn)確區(qū)分乳豬豬肝和成年豬豬肝，因此，可能出現(xiàn)企業(yè)收購的乳豬肝臟被成年豬肝臟所替代的風(fēng)險。目前國內(nèi)沒有檢測成年豬肝和乳豬肝的標(biāo)準(zhǔn)和方法，造成企業(yè)收購豬肝質(zhì)量檢測空白和質(zhì)量檢測監(jiān)督部門的監(jiān)管空白。為了解決這一問題，急需研究出一個適于常規(guī)檢測的方法，以區(qū)別來源于成年豬和乳豬的豬肝。

過氧化氫酶廣泛存在于動植物的各個組織、大部分需氧微生物體內(nèi)，是動植物體內(nèi)清除自由基的基本酶類[1]。過氧化氫酶的作用是催化細胞內(nèi)過氧化氫的分解，防止脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的氧化損傷[2]。動物體內(nèi)一般不同組織的過氧化氫酶活性不同，基本由大到小的排序是：肝、腎、肺、心、脾、胃、腦[3]。不同生長階段中，由于代謝能力的差異，動物肝臟中的過氧化氫酶的酶活性也存在差異。本文利用碘量法測定過氧化氫酶的酶活性大小，通過研究對比成年豬和乳豬的豬肝中過氧化氫酶的活性差異，建立簡單有效的生化檢測方法，鑒定成年豬肝和乳豬肝，實現(xiàn)藥企和監(jiān)管部門常規(guī)檢測和監(jiān)管，從而保障乳豬肝源藥品的質(zhì)量。

2 實驗材料

2.1 豬肝

成年豬肝在菜市場購買。乳豬肝由廣東中山市隆賦藥業(yè)提供。

2.2 試劑

pH分別為6、7、8、9的1%甘露醇緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol/L的磷酸鹽），保存于4 ℃的冰箱中；40 g/L鉬酸銨溶液，0.15 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.155 mol/L KCI溶液，0.9%NaCI溶液，0.1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 實驗方法

3.1 粗酶液的提取

本實驗采用緩沖液提取法來提取豬肝中的過氧化氫酶，先用紙巾擦凈豬肝表面的血水，將豬肝剝?nèi)ツひ拢腥ソY(jié)締組織后稱重，取成年豬肝10 g，按所需的料液比1∶8（豬肝：1%甘露醇磷酸緩沖溶液）及pH[4]加入相應(yīng)的1%甘露醇磷酸緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol/L的磷酸鹽），記號。分別于勻質(zhì)機中在2 000 r/min下攪碎30 s左右，制得的勻漿液分別在10 000 r/min下離心10 min，取上清液1 mL，最后用1%甘露醇磷酸緩沖溶液稀釋10倍，制得粗酶液。

3.2 過氧化氫酶活性測定方法

測定過氧化氫酶活性是利用過氧化氫酶能分解過氧化氫的特性，用一定量的粗酶液在25 ℃的條件下與足量的過氧化氫反應(yīng)規(guī)定時間后，終止其反應(yīng)。通過測定剩余過氧化氫的量，來計算豬肝中過氧化氫酶的活性。

計算公式：

將冷藏4 ℃冰箱內(nèi)的成年豬肝和乳豬肝，取出置于冰水浴中解凍。按粗酶液提取方法，稱取已冷藏的豬肝10 g，分別加入料液比為1∶8，pH為7.0、8.0、9.0的1%甘露醇磷酸緩沖溶液，制備豬肝粗酶液，做好標(biāo)記，置于冰水浴中待用。用Na2S2O3測定其酶活性，平行測定3次，并做空白對照組。

4 實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果與分析如表1～3所示。

表1 成年豬肝與乳豬肝中過氧化氫酶的活性對比實驗數(shù)據(jù)（耗用Na2S2O3體積，單位：mL）

表2 成年豬肝與乳豬肝中過氧化氫酶的活性對比實驗結(jié)果［單位mg·g-1·min-1］

實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果：行對比F＞Fcrit，且Pvalue＜0.01，這說明乳豬肝和成年豬肝過氧化氫酶活性兩組數(shù)據(jù)差異極其顯著。

5 結(jié)語

肝臟中含有的活性物質(zhì)有過氧化氫酶、線粒體F1-ATP合酶、谷氨酸脫氫酶、輔酶A等。其中過氧化氫酶在機體中廣泛存在，其中主要存在于細胞的過氧化物酶體內(nèi)，約占過氧化物酶體酶總量的40%，被認(rèn)定為是過氧化物酶體的標(biāo)志酶。孔德勝等[3]研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶的分布特點除具有一定的組織差異外，其量的多少還和動物的發(fā)育時期有關(guān)，同時受環(huán)境因子的影響。已報道小鼠各組織CAT的活性隨著年齡的變化表現(xiàn)出較大差異。小鼠肝、腎組織中過氧化氫酶的活性在1～4月齡間與年齡相關(guān)性不顯著，在4～18月齡間隨年齡增加而降低。小鼠肝、腎、肺、心、脾、胃、腦等組織中過氧化氫酶的活性隨年齡變化而變化，機體過氧化氫酶活性的降低與機體衰老密切相關(guān)[4]。關(guān)于過氧化氫酶活性在豬的組織（包括肝臟）中隨年齡分布的情況未見報道。本實驗顯示，乳豬肝中過氧化氫酶活性比成年豬肝的過氧化氫酶活性低，而且兩者差異極其顯著。通過研究發(fā)現(xiàn)，乳豬和成年豬的豬肝中過氧化氫酶活性存在明顯差異，可作為鑒別兩者的一個生化指標(biāo)。

表3 pH7.0成年豬肝與乳豬肝中過氧化氫酶的活性差異顯著性分析