pH和溫度敏感型聚合物熒光探針的合成及應用

劉建川

（西華師范大學 化學化工學院，四川 南充 637000）

在臨床中，生物標志物檢測對于臨床診斷及治療方案的制定均具有積極作用，為此，多年來其一直作為臨床醫學界及相關研究人員的主要關注方向，所呈現出的研究資料眾多。但是，傳統小分子熒光探針在溶解度、集成等方面還存在一定局限性[1]。以往有研究資料顯示，經由相應的化學方法應用，能夠促使小分子熒光探針融入聚合物體系中，從而形成功能性更為全面的聚合物探針，其與傳統熒光探針進行對比，所呈現出的主要差異是生物相容性有進一步提升，其檢測功能也實現了集成化[2]。在本次研究中，對pH和溫度敏感型聚合物熒光探針的合成及具體應用進行了分析，現報告如下。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗儀器

儀器：Bruker Avance 400核磁共振儀NMR，四甲基硅烷作為內標，測定環境在常態室溫條件下即可；Waters LCT Premier XE TOF型高分辨質譜儀；VARIAN Cary 100型紫外可見吸收光譜儀與CARIAN-Cary型熒光光譜儀；LAKECORE-SO400型超純水器；pHS-25型pH計；Waters1515-2414型凝膠滲透色譜儀，流動相為四氫呋喃。試劑：偶氮二異丁腈（AIBN）分析純，經乙醇重結晶純化；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM），分析純，經正已烷重結晶純化；單氨基-七異丁基POSS，分析純；四氫呋喃（THF），分析純，應用前經金屬鈉干燥與蒸餾，保存留用。

1.2 方法

1.2.1 NI（N-（2-甲基丙烯酰乙酯基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，8-萘酰亞胺）的合成

在容量為100 mL的實驗專業容器中，將N-（2-羥乙基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，0-萘酰亞胺（600 mg，1.8 mmol）溶到20 mL干燥二氯甲烷中，然后在此容器中增加三乙胺，劑量為0.25 mL，增加后不斷進行攪拌；將10 mL二氯甲烷溶解的甲基丙烯酰氯溶液，緩慢地注入容器中，本次研究中此環節采用滴注的方式，確保溶液能夠維持一定速度緩慢進入容器；將配置好的溶液放置在常溫環境中，促使其自然反應12 h。反應后的溶液減壓旋蒸除去溶劑，柱層析色譜分離，二氯甲烷/甲醇，獲取到黃色產物NI 330 mg，產率為46%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：1.87（s，3H，-CCH3），2.46（s，3H，-NCH3），2.77（s，4H，-（CH2）2N-），3.32（s，4H，-（CH2）2NCH3），4.47（t，J=5.2HZ，2H，-NCH2-），4.54（t，J=5.2HZ2H，-CH2O-），5.50（s，1H，alkene-H），6.05（s，1H，alkene-H），7.22（d，J=8.0HZ，1H，Ph-J），7.69（t，J=7.2HZ1H，Ph-H），8.40（d，J=8.4HZ，1H，Ph-H），8.25（d，J=8.0HZ1H，Ph=H），8.57（d，J=7.2HZ1H，Ph-H）。HRMS（ESI-MS）：計算值C23H26N3O4[M+H]＋408.192 3，實際測量結果為408.193 3。

1.2.2 POSS-CTA（雙硫酯基-異丁基-POSS鏈轉移劑）的合成

在容量為100 mL的容器中，加入AOPOSS，劑量為2 g，將其溶解到50 mL干燥二氯甲烷中，持續進行攪拌；在攪拌一定時間后，將2-溴丙酰溴（0.65 g，3 mmol）的20 mL干燥二氯甲烷稀釋液注入容器中，本次研究采用滴注方式，促使其能夠維持一定速度緩慢進入到容器中，將配置完成的溶液放置到常溫環境中，使其自然反應12 h。自然反應完成后減壓旋蒸除去溶劑，乙醇重結晶，真空干燥獲取到白色固體POSS-Br2.08 g，收率87%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：0.63-0.58（m，15H，-SiCH2-），0.96（d，J=6.8HZ，42H，-CH（CH3）2-），1.67-1.58（m，2H，-SiCH2CH2-），1.89-1.80（m，7H，-SiCH2CH-），1.89（d，J=6.6HZ，3H，-CHBrCH3），3.27（q，J=6.8HZ，2H，-NHCH2-），4.41（q，J=6.6HZ，1H，-CHBrCH3），6.41（s，1H，-NH-）。HR MS（ESI-MS）：計算值C34H75NO13Si8Br[M+H]＋：1 008.257 6，實測值1 008.257 1。

1.2.3 Poly（POSS-NI-NIPAM）合成

選用容量為25 mL的史萊克管作為容器，首先在容器中加入N-異丙基丙烯酰胺，加入量為0.567 g，5.010 mmol，后加入鏈轉移劑POSS-CTA，加入量為35 mg，0.033 4 mmol，后加入NI，加入量為10 mg，0.024 6 mmol，后加入1mL干燥四氫呋喃與AIBN，加入量為2.4 mg，0.016 7 mmol。在所有試劑均添加完成后，進行凍融脫氣循環，反復操作3次，完成此項操作后對其進行加熱處理，至65 ℃停止加熱，自然反應9 h。將完成反應后的液體緩慢滴入到200 mL的冷乙醚中進行沉淀處理，持續沉淀2次，最終形成顏色為黃色的固體，重量為0.547 g。最終獲得物質數均相對分子質量12 565，質均相對分子質量18 353，多分散性指數PDI1.46。

2 結果

2.1 合成與表征

POSS-CTA的合成經由兩步有機合成反應合成RAFT反應鏈轉移劑POSS-CTA。（1）AIPOSS與2-溴丙酰溴經由親核加成與消除反應獲取到熱力學穩定的中間體POSSBr。（2）將丙酮作為溶劑，乙基黃原酸鉀上硫原子親核進攻POSS-Br，生成溴化鉀與鏈轉移劑POSS-CTA、此種合成策略較為簡便，且合成過程所應用到的原料容易獲取。

2.2 Poly（POSS-NI-NIPAM）結構

從N-異丙基丙烯酰胺開始，以無水四氫呋喃作為溶劑，AIBIA作為鏈引發劑，POSS-CTA作為鏈轉移劑，合成共聚物Poly（POSS-NI-NIPAM）。經由1H-NMR與GPC對Poly結構及相對分子質量分別進行表征。在Poly核磁共振氫譜中，萘酰亞胺單元中-OCH2CH2N-的亞甲基氫化學位移出現在4.39位置，茶酰亞胺中甲基哌嗪基團的-CH3甲基氫，聚合物核磁氫譜結果充分顯示出各單位均成功參與聚合反應。GPC測試結果顯示出，Poly數均相對分子質量（Mn）為12 565，質均相對分子質量（Mw）為18 353，多分散性指數1.46。此結果充分證實，應用RAFT反應生成的聚合物相對分子質量可控，且分布均勻。詳細情況如圖1所示。

圖1 Poly在DMSO-d6的核磁共振氫譜圖

針對不同濃度茶酰亞胺單體NI的吸收光譜實現滴定測試，同時將其在400 nm處的吸光度值與質量濃度變化做線性關聯，獲取公式為：

A：A400=9.944 6c-0.001 14，R=0.999 9，公式中濃度為1.0 g/L Poly溶液在吸收光譜400 nm位置吸光度為A400=0.369 85，代入公式獲取到聚合物中單體NIPAM與NI之間摩爾比為233∶1。

2.3 探針與pH變化響應檢測

經由對系統測試條件的優化，茶酰亞胺單體在乙醇溶液中熒光量子產率較高，將Poly水溶性作為考慮因素，各光譜測試均應用V（水）∶V（乙醇）=9∶1體系?？紤]到萘酰亞胺單體NI對pH優異的響應性能，對聚合物探針Poly處于不同pH條件下實現光譜性質試驗。紫外-可見吸收光譜顯示出，在pH從10.0到2.2過程中，Poly最大吸收波長輕微籃移，且在200 nm部位出現等吸收點。應用等吸收點400 nm作為激發波長，在pH為10.0時，Poly初始狀態的熒光較弱，其原因可能為萘酰亞胺與哌嗪基團臨近氮原子之間PET過程致使萘酰亞胺熒光猝滅。隨著pH的持續降低，能夠發現萘酰亞胺中哌嗪單元發生質子化反應，PET過程在被動狀態下停止，NI熒光強度逐漸恢復，熒光強度變化與pH變化呈現良好線性關系。

2.4 探針對溫度變化響應檢測

為明確熒光探針是否會受到溫度條件的影響，在本次研究中特對探針在溫度變化中的響應情況進行了觀察，調查結果顯示出，低溫環境中，可觀察到較為清澈的溶液，隨著溫度的不斷上升，原本清澈的溶液會逐漸渾濁?；趐H=7.14條件，Poly處于25 ℃狀態下，在400 nm部位吸光度出現顯著變化，代表著聚合物在此過程中發生從親水到疏水的變化。聚合物體系Poly在520 nm位置熒光在溫度的不斷升高下而有所降低，僅在相轉變時，熒光強度會逐漸加強。此結果代表著在溫度的不斷升高下，萘酰亞胺分子熱運動致使熒光逐漸猝滅，在溫度至LCST時，微環境從極性變化為非極性，聚合物在溶液中從伸展的線團結構變化為緊密的球狀結構，熒光表現為突然增強。另外，實驗結果顯示出，探針在pH變化（4.22/10.09）與溫度變化（20～40 ℃）時，Poly熒光強度可逆循環性能良好，代表著Poly適合成為聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化的材料。

3 討論

熒光探針是其熒光性質能夠在周圍環境性質的轉變下而作出適當改變的一種熒光性分子，主要作用為探究大分子物質的性質與行為[3]。熒光探針多應用在熒光免疫法中標記抗原或是抗體，同時也可應用在微環境中的探測，包括表面活性劑膠束、雙分子膜等[4]。應用可逆加成斷裂自由基聚合反應設計合成基于萘酰亞胺染料與N-異丙基丙烯酰胺單體的pH/溫度雙響應聚合物熒光探針Poly。

一系列實驗證實，探針在pH變化（4.22/10.09）與溫度變化（20～40 ℃）時，Poly熒光強度可逆循環性能良好，探針在pH5.8～8.0條件中，pH檢測性能較好，熒光變化與pH成線性相關，Poly對pH及溫度具有教好可逆循環檢測性能，代表著Poly適合應用在聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化中[5]。

Poly適合成為聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化的材料，在生物樣本pH/溫度變化檢測中具有較大應用價值。