分枝桿菌雙相羅氏培養基在結核病診斷中的應用研究

宋媛媛 劉二勇 陶波山 黃費湘 肖亞利 藍如束 譚云洪 李輝 葉磊 成詩明 趙雁林

結核病細菌學診斷的“金標準”是培養法，其既是結核病最可靠的檢測方法，也是獲得陽性培養物進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)及分子生物學檢測研究的基礎。目前，公認的結核分枝桿菌培養方法有2種，即快速液體培養法和固體羅氏培養法?？焖僖后w培養法檢測結果報告的時間快，陽性結果報告時間一般為10～20 d，陰性結果報告時間為42 d，但其價格昂貴，需要特殊儀器，在基層醫療衛生機構使用受到一定的限制。固體羅氏培養法是傳統的培養方法，也是我國普遍應用的分枝桿菌培養方法，報告結果的時間較長，一般陽性結果報告時間為20～30 d，陰性結果報告時間為56 d。其價格低廉，能在縣(區)級基層醫療衛生機構使用。

分枝桿菌雙相羅氏培養基(簡稱“雙相培養基”)是一種能促進分枝桿菌快速生長的新型培養基，陰性結果報告時間為42 d。其結合了改良羅氏培養基和液體培養基的優點，分枝桿菌可在培養基的固體斜面上形成典型的菌落，同時又因為含有顯色劑，在液體培養基中呈現粉紅色或紅色顆粒狀生長。為探討該培養基在基層實驗室推廣應用的可行性，筆者選取我國3個省的3個地市級結核病診療機構，采用多中心試驗方法評價該培養基在結核病診斷中的價值。

材料和方法

1.研究對象：連續納入2014年10月至2015年10月在廣西壯族自治區北海市結核病防治院、湖南省邵陽市結核病防治醫院、河南省南陽市第六人民醫院就診的初診肺結核可疑癥狀者作為研究對象，共計2320例。其中，肺結核患者1176例，非肺結核患者1144例；其中，男1536例(66.21%)，女784例(33.79%)；最小年齡10歲，最大年齡104歲，年齡中位數(四分位數)[M(Q1,Q3)]為50(33, 63)歲；其中15例因分枝桿菌改良羅氏培養基(簡稱“羅氏培養基”)和雙相培養基中的1種或2種培養污染或結果缺失，故在兩種培養基檢測結果進行比較時不計入分析。由接受過培訓的臨床醫生詢問研究對象的基本信息、本次就診癥狀及病史，并結合細菌學檢查和X線胸部攝影(簡稱“胸片”)結果，參考《WS 288—2008 肺結核診斷標準》[1]診斷肺結核患者。每例患者均有胸片，并均留取3份痰標本(即時痰、夜間痰、晨痰)進行萋-尼染色法涂片鏡檢(簡稱“涂片”)，并選取2份性狀好的痰標本同時進行羅氏培養基培養、雙相培養基培養。

2.試劑及培養基：萋-尼染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。羅氏培養基購自河南省賽諾特生物技術有限公司，由7 ml改良羅氏培養基組成，陰性結果觀察至第8周報告。雙相培養基購自珠海市銀科醫學工程股份有限公司，由固體和液體兩部分組成；固體部分含有7 ml國內外通用的改良羅氏培養基成分，液體部分由3 ml基礎培養基、促生長劑、抑菌劑和顯色劑組成；陰性結果觀察至第6周報告。

3.涂片鏡檢：萋-尼染色法涂片鏡檢遵照《痰涂片顯微鏡檢查標準化操作及質量保證手冊》[2]中的標準化操作程序執行。

4.痰標本前處理方法及培養：采用中和離心法對同一份痰標本進行去污染處理，分別接種0.1～0.15 ml在羅氏培養基和雙相培養基上進行培養，遵照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[3]中的標準化操作程序執行。

5.質量保證：(1)制定項目實驗室標準化操作程序手冊及質量保證手冊。(2)研究人員統一經過培訓合格。(3)國家級和省級疾控中心(結核病防治所)對項目點每3個月進行1次督導。(4)每月進行數據統計分析，包括標本量、陽性率、涂陽培陽率、涂陽培陰率、污染率。

6.統計學處理：使用SPSS 24.0軟件，采用配對χ2檢驗比較兩種培養基的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統計學意義；分別以羅氏培養基培養結果、臨床診斷為標準對雙相培養基的檢測效能進行評價；采用Wilcoxon秩和檢驗對羅氏培養基與雙相培養基檢出時間的差異進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.陽性檢出率：在初診肺結核可疑癥狀者中，涂片陽性率為15.30%(355/2320)； 羅氏培養基和雙相培養基兩種培養方法陽性檢出率分別為19.65%(453/2305)和22.00%(507/2305)，后者較前者高2.34%，差異有統計學意義(χ2=22.091，P=0.000)。在臨床診斷的肺結核患者中，涂片陽性率為30.19%(355/1176)；涂片加羅氏培養基培養陽性率為43.11%(507/1176)；涂片加雙相培養基培養陽性率為46.34%(545/1176)。

2.以羅氏培養基培養結果為標準對雙相培養基檢測效能的評價：雙相培養基的敏感度為91.39%(414/453)，特異度為94.98%(1759/1852)，一致率為94.27%(2173/2305)(表1)。假陰性率為8.61%(39/453)，假陽性率為5.02%(93/1852)。在雙相培養基檢測出現假陰性的39例患者中，有24例涂片結果為陰性，8例涂片結果為1～8條/300個視野或+；有15例羅氏培養基培養結果為實際菌落數，13例羅氏培養基培養結果為+；在雙相培養基檢測出現假陽性的93例患者中，雙相培養基培養結果均為實際菌落數。

3.以臨床診斷為標準評價羅氏培養基和雙相培養基的診斷價值：羅氏培養基診斷肺結核患者時ROC曲線下面積為0.694(95%CI：0.672～0.715)，與完全無價值的診斷試驗曲線下面積0.5相比較差異有統計學意義(Z=17.636,P=0.000),診斷價值較低。雙相培養基診斷肺結核患者時ROC曲線下面積為0.707(95%CI：0.685～0.728)，與完全無價值的診斷試驗曲線下面積0.5相比較差異有統計學意義(Z=18.818,P=0.000),診斷價值中等。對兩種培養基的曲線下面積進行比較，差異無統計學意義(Z=0.836，P=0.403)(圖1)。

圖1 以臨床診斷為標準，羅氏培養基和雙相培養基診斷肺結核患者的ROC曲線

4.羅氏培養基與雙相培養基報陽時間分析：羅氏培養基報陽時間中位數(四分位數)[M(Q1,Q3)]為28(21,34) d，雙相培養基報陽時間M(Q1,Q3)為18(14,24) d，雙相培養基比羅氏培養基報陽時間明顯縮短，差異有統計學意義(Z=15.114，P=0.000)。不同涂片結果使用雙相培養基較羅氏培養基報陽時間均明顯縮短，差異均有統計學意義(表2)。

表1 以羅氏培養基培養結果為標準對雙相培養基檢測效能的評價

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%

表2 不同涂片結果使用羅氏培養基和雙相培養基報陽時間比較

討 論

在結核病防治工作中快速診斷結核病至關重要，診斷結核病的金標準是培養法。據文獻報道雙相培養基、加入不同營養物的固體培養基、各類液體培養基與羅氏培養基培養結果相比，陽性檢出率提高分別在0.8%～7.2%[4-6]、1.6%～7.1%[7-9]、0.4%～7.5%[10-14]之間。本研究雙相培養基較羅氏培養基陽性檢出率提高2.34%，與文獻報道相符。雙相培養基液體部分可達到快速培養的目的，固體部分可提供分枝桿菌典型菌落，體現了雙相培養基的優點[15]；一般的液體培養基陽性菌落呈白色顆粒狀，難以鑒別菌落特性[5]，本研究的雙相培養基在液體培養基中加入了顯色劑，實驗員可通過肉眼觀察雙相培養基變色情況判斷是否有分枝桿菌生長。

本研究顯示雙相培養基的敏感度為91.39%，特異度為94.98%。據文獻報道[16-20]，雙相培養基、加入不同營養物的固體培養基、各類液體培養基的敏感度在67.3%～98.3%、特異度在84.4%～100%，本研究結果在文獻報道范圍內，且敏感度、特異度較高。雙相培養基與羅氏培養基培養結果的一致率為94.27%，假陰性率為8.61%，假陽性率為5.02%。在雙相培養基檢測出現假陰性的39例患者中，有24例涂片結果為陰性，8例涂片結果為1～8條/300個視野或+；有15例羅氏培養基培養結果為實際菌落數，13例羅氏培養基培養結果為+，由此得出盡管羅氏培養基檢出陽性，但陽性級別較低，而且多數是僅為其中1份痰標本檢出陽性，且涂片結果大多為陰性，因此雙相培養基沒能檢出也存在較大可能。出現假陽性的原因主要是雙相培養基診斷價值較高，檢出了羅氏培養基沒有檢出的一部分患者。出現假陽性的93例患者中，雙相培養基培養結果均為實際菌落數，這說明雙相培養基在培養含菌量極低的痰標本時具有更高的陽性檢出率。盡管兩種培養基的ROC曲線下面積不是太高，主要因為比較對象是臨床診斷。結核病的臨床診斷主要依據臨床癥狀和體征，結核分枝桿菌病原學、病理學、影像學等檢查的證據[21]。雖然細菌學診斷是結核病診斷的“金標準”，但痰涂片的陽性檢出率較低，痰培養雖可提高陽性檢出率，但也不足50%[22]。根據2018年全球結核病報告，我國2017年活動性肺結核患者病原學陽性率為32%[23]。《“十三五”全國結核病防治規劃》[24]中提出肺結核患者病原學陽性率需達到50%以上。本研究在活動性肺結核患者中，涂片陽性率為30.19%，涂片加羅氏培養基培養陽性率為43.11%，涂片加雙相培養基培養陽性率為46.34%，使用雙相培養基培養陽性率已經更接近50%的目標，也提示需要采取結核分枝桿菌核酸檢測來進一步提高病原學陽性率。

雙相培養基較羅氏培養基報陽時間縮短10 d，略高于文獻報道的縮短6～9.3 d[10,25-27]。而且在不同陽性級別的痰標本中也表現出更短的報陽時間，差異均有統計學意義。隨著涂片陽性級別升高，雙相培養報陽時間隨之更短，報陽時間與標本中的活菌量有關, 活菌量越大, 平均報陽時間越短[28]。本研究證實了這一結論。

雙相培養基較羅氏培養基具有更高的陽性檢出率，診斷價值較高，報陽時間明顯縮短，是一種可以作為結核病臨床診斷的參考方法，在我國基層實驗室有一定推廣應用價值。

志謝湖南省邵陽市結核病防治醫院、廣西壯族自治區北海市結核病防治院、河南省南陽市第六人民醫院工作人員在研究現場所付出的努力與辛勤工作！