陰陽攻積丸成分分析及其中肉桂醛、6-姜酚、吳茱萸堿的含量測定*

郭文海 李 躍 鄒增城 李義偉 李永偉

陰陽攻積丸(Yin Yang Gong Ji pill，YYGJ)源自《醫宗必讀》，系明朝李中梓創制，主治五積、六聚，七癥、八瘕，痰食等[1]。原文如下：“吳茱萸，干姜，官桂，炮川烏，各一兩，炒黃連，洗半夏，橘紅，茯苓，檳榔，炒厚樸，炒枳實，石菖蒲，炒延胡索，去蘆人參，沉香、琥珀另研，桔梗各八錢，巴豆霜另研，五錢。以上各藥為細末，皂角六兩，煎汁，泛為丸，如綠豆大，每服八分，漸加至一錢五分，生姜湯送服”，功效為溫中理氣、化痰導滯、破癥散積[2]。本課題組前期實驗研究證明該方可抑制HepG2細胞增殖，促進其凋亡，可調節肝癌上皮間質轉換(EMT)的關鍵分子Vimentin和E-cadherin，抑制基質金屬蛋白酶MMP，防止其溶解細胞外基質為轉移提供條件，初步顯示具有抑制肝癌的藥效[3]。陰陽攻積丸全方共20味藥，具體的化學成分尚不清楚，本研究采用TOF MS-IDA-TOF MS/MS數據采集方法定性檢測所有成分，其中吳茱萸、肉桂和干姜為復方中3種同等劑量的主要用藥，每味用量僅次于君藥皂角，故采用高效液相定量檢測這3種中藥的成分吳茱萸堿、肉桂醛和6-姜酚，以了解陰陽攻積丸的療效基礎。

1 儀器與試藥

液相：島津公司30A超高效液相色譜系統；質譜：AB SCIEX公司API4000QTRAP質譜系統。對照品：吳茱萸堿(貨號BWB50890[115416]，純度HPLC≥99.52%)、6-姜酚(貨號BWB50536[113429]，純度HPLC≥98%)、肉桂醛(貨號BWB50758[114206]，純度HPLC≥98%)，均購自北京北納生物。

陰陽攻積丸(批號20181111)，由本實驗室自制，藥材來源于中山大學附屬第三醫院中藥房，經主任藥師鑒定，分別按前述制備[3]，保存于4 ℃備用，4 g/粒。甲醇為色譜純，由MERCK公司提供，實驗用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液精密稱取對照品適量于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液稱取40 mg藥丸，加入25 ml的甲醇和水混合液(8∶2，v/v)，渦旋振蕩5 min，放置30 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析。

2.2 質譜條件采用TOF MS-IDA-TOF MS/MS數據采集方法，霧化氣流量：55 L/min，輔助霧化氣流量：50 L/min，氣簾氣流量：25 L/min，噴霧電壓：5500 V(正離子)或-4500 V(負離子)，離子源溫度：550 ℃，動態背景扣除功能打開。肉桂醛在(+)ESI 源電離方式下，主要生成[M+H]+峰為m/z 133。選擇性對[M+H]+峰進行產物離子全掃描分析，肉桂醛生成的主要碎片離子分別為m/z 115 和m/z 105，將以上主要碎片離子作為定量分析時監測的產物離子。6-姜酚在(+)ESI 源電離方式下，發生源內裂解，主要生成[M+H]+峰為m/z 295.2。選擇性對[M+H]+峰進行產物離子全掃描分析，6-姜酚生成的主要碎片離子分別為m/z 277.2和m/z 177.2，將以上主要碎片離子作為定量分析時監測的產物離子。吳茱萸堿在(+)ESI 源電離方式下，主要生成[M+H]+峰為m/z 304.2。選擇性對[M+H]+峰進行產物離子全掃描分析，吳茱萸堿生成的主要碎片離子分別為m/z 134.2和m/z 171.2，將以上主要碎片離子作為定量分析時監測的產物離子。肉桂醛、6-姜酚、吳茱萸堿3個化合物在ESI正離子模式下檢測，霧化氣流量：55 L/min，輔助霧化氣流量：50 L/min，氣簾氣流量：25 L/min，噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：550 ℃。

2.3 色譜條件流動相A為水相，水；流動相B為有機相，甲醇。流速為0.4 ml/min。色譜柱：Phenomenex C18(2.1×50 mm, 5 μm)，柱溫35 ℃，檢測波長215 nm，290 nm，280 nm。優化后的洗脫梯度: 流動相B相在0.3 min比例為25%，在3.0 min B相比例線性上升至95%，維持至4.9 min，在5.0 min降至25%，總色譜洗脫時間為7.0 min。

2.4 定性結果除定量檢測吳茱萸堿、6-姜酚和肉桂醛外，采用高分辨質譜法全掃描采集藥物成分一級和二級信息，正離子模式的采集總離子流圖見圖1，負離子模式的采集總離子流圖見圖3。

注：粗線為一級MS總離子流圖，細線為二級MS/MS總離子流圖

所采集的數據搜索SCIEX公司中藥數據庫進行二級圖譜匹配，匹配圖譜見附圖，藍色離子為藥丸中采集的目標物碎片離子，灰色離子為數據庫中碎片離子，兩者進行鏡像對比，匹配度大于60%則認為匹配成功。綜合鑒定結果藥丸中含有沉香四醇、丁香醛、四氫小檗堿、小檗堿、香葉木素、小檗紅堿、橘皮素、異甘草素、槲皮素等52種成分。見圖3～圖11。

注：粗線為一級MS總離子流圖，細線為二級MS/MS總離子流圖

圖3 香葉木素

圖4 小檗紅堿

圖5 小檗堿

圖6 丁香醛

圖7 四氫小檗堿

圖8 沉香四醇

圖9 橘皮素

圖10 異甘草素

圖11 槲皮素

2.5 線性關系考察稱取“2.1.2”項下貯備液各2.0 ml，用50%甲醇依次稀釋制成系列質量濃度對照品溶液，在“2.3”色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，各成分在各自范圍內線性關系良好。見表1。

表1 陰陽攻積丸3種成分線性關系

2.6 重復性實驗取陰陽攻積丸,按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定。吳茱萸堿、肉桂醛、6-姜酚 的RSD分 別 為1.08%、1.62%、0.98%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.7 精密度實驗吸取對照品溶液10 μl，注入色譜儀，重復進樣5次，記錄峰面積。結果，吳茱萸堿、肉桂醛、6-姜酚 的RSD分 別 為1.08%、0.89%、1.32%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性實驗取陰陽攻積丸,“2.1.2”項下供試品溶液,分別于0 h，3 h，6 h，12 h、14 h、16 h在上述色譜條件下測定。以峰面積為指標計算RSD考察供試品溶液的穩定性。結果吳茱萸堿、肉桂醛、6-姜酚在6個時間點所測各色譜峰峰面積的RSD分 別為0.9%、1.18%、1.29%(n=6),表明供試品溶液在16 h內穩定。

2.9 加樣回收率實驗取含有量已知的同1批丸劑適量，傾出內容物，混勻，精密稱取5份，置于錐形瓶中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，肉桂醛、吳茱萸堿和6-姜酚平均加樣回收率分別為100.79%、91.63%、98.77%，RSD分 別 為1.65%、1.95%、1.02%。見表2。

表2 加樣回收率結果 (n=5)

2.10 樣品含有量測定丸劑按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算含有量。分別采用肉桂醛、6-姜酚和吳茱萸堿標準曲線進行定量分析濃度平均分別為80.4 μg/ml、1973.2 ng/ml、22.1 ng/ml，換算含量后即平均每毫克藥丸中含有1.9 μg肉桂醛，47.5 ng 6-姜酚，0.53 ng吳茱萸堿。見圖12。

注：(d)總離子流圖：1～3分別為肉桂醛、6-姜酚和吳茱萸堿

3 討論

陰陽攻積丸整方以皂角煎液水泛為丸, 生姜湯送服，皂角180 g為最大劑量藥物，應為君藥；溫熱藥物吳茱萸、干姜、肉桂、川烏各30 g均為臣藥，具有“益火之源，以消陰翳”之意，可以祛寒化痰。《類證治裁》卷三指明該方主治五積六聚，七癥八瘕，痃癖皆效，現代醫學的腫瘤多歸屬于此類疾病，但現代藥效學研究尚未見報道。

現代醫學中超過一半的抗癌化療藥來源于天然產物及其衍生物，因此中藥的抗癌成分值得關注。TOF MS-IDA-TOF MS/MS共測得陰陽攻積丸中含有52種成分。其中的吳茱萸堿既往文獻報道具有多靶點抗腫瘤增殖的功效，包括了肺癌、肝癌、白血病等共19種癌癥，吳茱萸堿的抗癌作用與抑制細胞周期、增殖、侵襲和血管生成以及凋亡有關[4]。Yang等[5]報道吳茱萸堿通過降低磷酸化-Akt水平，升高凋亡蛋白Bax及裂解的caspase-3 和 PARP 多聚酶水平，抑制HepG2細胞增殖和細胞周期。吳茱萸堿的抗肝癌活性還與其激活含WW結構域的氧化還原酶有關[6]。另外，吳茱萸堿和小檗堿可協同作用誘導 SMMC-7721肝癌細胞死亡[7]。陰陽攻積丸配方中有吳茱萸和黃連，采用高分辨質譜可檢測到吳茱萸堿和小檗堿成分，可能是其抗肝癌的成分組合之一。吳茱萸堿溶于丙酮，略微溶于乙醇、乙醚及氯仿，幾乎不溶于水，低水溶性限制了應用，因此也開發了更多的衍生物及制劑，如納米包封的吳茱萸堿[8]等等。Wu等[9]研究顯示肉桂醛可通過ROS介導的細胞色素C釋放和caspase-3激活誘導人PLC/PRF/5肝癌細胞凋亡。肉桂醛的衍生物BCA可促進脾細胞產生，增強刀豆蛋白刺激的脾細胞增殖，誘導淋巴細胞進入肝臟，最終抑制動物模型的肝癌進展[10]，而在HepG2細胞株，肉桂醛通過激活p53和CD95信號通路誘導細胞凋亡[11]。6-姜酚可改變腫瘤內血管網的分形幾何特征，降低微血管結構熵，促進腫瘤微血管網絡結構正常化，并因此顯著增強化療藥順鉑藥效，降低其不良作用，可能是溫里藥的抗腫瘤作用機制之一[12]。

綜上，可以看出溫里藥與清熱解毒藥同樣具有抗癌療效。吳茱萸堿、肉桂醛、6-姜酚可能是陰陽攻積丸發揮抗癌療效的重要成分。《中藥大辭典》記載皂角辛，溫，微毒, 功能主治祛風痰，除濕毒殺蟲,含抗腫瘤化學成分三萜皂甙-皂莢皂甙B-G(gleditsiasaaponin B-G)，但本課題組未能搜索到國內外有此成分對照品出售,故未能檢測。高效液相可檢測到3種臣藥成分吳茱萸堿、肉桂醛和6-姜酚，具有較好穩定性、重復性、精密度，但吳茱萸堿回收控制率相對較低，可進一步探索其檢測方法。