芽孢桿菌（Bacillus spp.）防治豇豆根腐病效果

胡洪濤 ，朱志剛 ，李金泉 ，曹春霞 ，邱正明 ，姚經武 ，陳偉 ，祝花 ，王孝琴

（1.湖北省生物農藥工程研究中心，武漢，430064；2.湖北省農業科學院經濟作物研究所；3.武漢市農業技術推廣中心）

豇豆根腐病為豇豆苗期重要土傳性病害，在全國豇豆主產區普遍發生，嚴重時，死亡率高達70%以上。研究認為，武漢地區的豇豆根腐病的病原為茄腐皮鐮刀菌（Fusarium solaniSchl.）[1]，而四川學者報道F.commune也可引起豇豆根腐病[2]，但不排除有不同鐮刀菌侵染的可能[3]。一般認為，鐮刀菌從根部或者莖基部侵染，導致表皮腐爛、維管束堵塞，植株萎焉死亡。該菌可長期在土壤中營腐生生活，可隨雨水、農事操作等，進行遠距離傳播，而排水不暢、低洼積水的田塊，發病較為嚴重。根腐病的防治，生產上主要采用化學藥劑，如噁霉靈、甲霜靈等，進行灌根，但由于農戶育苗時，常常采用田土，導致種苗帶菌，移栽后，再進行藥劑防治效果差，而且化學藥劑灌根的濃度和用量，都要顯著超過葉面噴霧。因此，研究新型的生物農藥，替代化學藥劑，減少化學農藥用量，是化肥和農藥減施的攻關任務順利完成的重要保障。

本研究通過生長抑制法，發現芽孢桿菌（Bacillusspp.）對豇豆根腐菌（Fusariumspp.）具有較好的抑制作用，同時，采用拌種和灌根的方法，能夠有效控制豇豆根腐病的發生，為研發控制豇豆根腐病的新型生物農藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗田概況

試驗于2016年4～6月，在湖北省農業科學院經濟作物研究所南湖試驗站進行，試驗田為多年豇豆連作田，根腐發病率高達75%以上。土壤pH值5.35，N、P、K 含量偏低。

1.2 豇豆根腐病菌

豇豆根腐病菌（Fusariumspp.）分離于湖北省農業科學院經濟作物研究所南湖試驗站豇豆根腐病病株，保存于湖北省生物農藥工程研究中心。豇豆根腐病菌采用PA液體培養基培養5～7 d后，采用無菌紗布將孢子過濾出來，調整孢子懸浮液濃度至1×106個孢子/mL，備用。

1.3 芽孢桿菌制備

芽孢桿菌（Bacillusspp.）為湖北省生物農藥工程研究中心分離和保存。超低溫甘油保存的菌株，首先在LB固體培養基上活化，挑取單菌落在NA液體培養基發酵24 h，經鏡檢無污染后，作為種子在50 L發酵罐中進行大量發酵48～72 h，發酵完成后，調整菌的濃度至1×108CFU/mL，于4℃保藏，備用。

1.4 芽孢桿菌活性評價

采用對峙培養法，評價芽孢桿菌對豇豆根腐菌的生長抑制活性。方法簡述如下：先將豇豆根腐菌在PDA培養基培養2～3 d后，用無菌的打孔器，將靠近菌落邊緣的菌絲打成菌絲塊，接種于PDA培養基平板中心，并將芽孢桿菌接種于距根腐菌3 cm左右的地方，置于28℃恒溫培養箱中培養3～5 d后，檢測結果。

將芽孢桿菌發酵液，加入等體積的乙酸乙酯，放置于搖床（150 r/min，30℃）振蕩 1.5 h 后，靜置 1～2 h，酯相采用旋轉蒸發儀進行旋蒸，殘留物經稱重后，用甲醇溶解，按照倍比稀釋法，采用紙碟法進行生物測定，根據抑菌圈的大小計算抑制中濃度（EC50）。

將PDA培養基固體加熱融化，冷卻至50℃左右，按每250 mL培養基，加入1 mL孢子懸浮液，混勻后，倒入培養皿，待培養基凝固。

取20 μL芽孢桿菌發酵液提取物，加入消毒后的濾紙碟片，待干燥后，放入含豇豆根腐菌平板，25℃培養 3～5 d，檢查抑菌結果。

1.5 芽孢桿菌拌種防治豇豆根腐病效果評價

芽孢桿菌發酵液，分別按照藥種比25 mL∶1 kg、50 mL∶1 kg、100 mL∶1 kg 進行拌種， 對照藥劑為30%噁霉靈水劑（市售），按照藥種比4 mL∶1 kg拌種。加入藥劑，充分攪拌均勻、陰干后，播入穴盤。并用清水拌種，作為空白對照（CKT）。 播種后24 h，將根腐菌孢子灌入穴盤，25 mL/穴。穴盤置于25℃人工溫室內，12 h光照，12 h黑暗。

1.6 芽孢桿菌灌根防治豇豆根腐病田間試驗

芽孢桿菌采用3個濃度處理，分別稀釋50倍，100倍和200倍，對照藥劑30%噁霉靈水劑稀釋1 000倍，分別在移栽時、移栽后10 d和20 d，按250 mL/株進行灌根。每處理100株，重復3次，另設清水對照（CKD）。

1.7 結果調查與分析

于豇豆播種7 d后，檢測豇豆發芽率。播種后30 d，觀察和記錄豇豆發病情況。大田試驗，在最后一次施藥后20 d，檢查根腐病發病率、株高和根長等指標。數據輸入Microsoft Excel進行處理，采用SPSS 19.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌發酵液對豇豆根腐病抑菌效果

平板對峙試驗結果顯示（圖1），芽孢桿菌對豇豆根腐病菌的生長具有較好的抑制作用，其發酵產物對豇豆根腐菌的EC50為24.4 mg/L，說明該菌代謝產物中具有較好的抗菌物質。

2.2 芽孢桿菌拌種防治豇豆根腐病效果

圖1 芽孢桿菌對豇豆根腐菌的平板抑制效果

表1 不同藥劑拌種處理對豇豆發芽率和對根腐病的影響

表2 不同藥劑灌根對豇豆根腐病田間防治效果

采用3種不同濃度的芽孢桿菌拌種 （表1），豇豆發芽率分別為96.5%、96.6%和93.3%，以藥種比50 mL∶1 kg的發芽率為最高，均顯著高于對照發芽率（83.2%），其中T1和T2處理的發芽率略高于對照30%噁霉靈水劑拌種（T4），而T3處理略低于噁霉靈拌種（T4），但在統計學上均無顯著性差異。

由表 1 可知，T1、T2、T3處理對豇豆根腐病的防效分別為 76.8%、77.8%、89.1%， 其中 T1、T2處理防效顯著性低于30%噁霉靈水劑（P＜0.05），而T3處理與噁霉靈處理無顯著性差異。

2.3 芽孢桿菌灌根防治豇豆根腐病田間試驗效果

由表 2 可知，D1、D2、D3處理豇豆根腐病發病率分別為19.3%、34.3%、47.3%，顯著低于對照發病率（P＜0.05），同 30%噁霉靈水劑（D4，14.7%）比較，D1處理防效與其無顯著差異，而D2和D3處理發病率顯著高于噁霉靈處理。

芽孢桿菌灌根處理（D1、D2、D3）對根腐病的田間防效分別為 74.9%、55.5%、39.1%，D1處理防效（74.9%）與 30%噁霉靈處理（D4，81.4%）無顯著差異（P＜0.05），但 D2和 D3處理顯著低于噁霉靈處理。

3 結論與討論

豇豆是湖北省乃至全國的主栽蔬菜品種之一，而豇豆根腐病在豇豆主產區普遍發生，由于豇豆生長季為4～6月，正逢長江流域梅雨季節，豇豆根腐病發生加重。豇豆根腐病的防治，多采用藥劑灌根處理，然而，由于豇豆根腐菌的初侵染很多時候發生在苗床，移栽到大田時，即使用藥防治，效果也不理想。因此，篩選有效的種衣劑或者拌種劑，從源頭控制根腐病的發生，才能更好地防治根腐病。本研究篩選出的芽孢桿菌拌種處理，對豇豆根腐菌生長具有較好的抑制效果，既能較好地促進豇豆種子萌發，也能預防根腐病的發生。同時，田間灌根處理，能較好地防治豇豆根腐病的發生，其高濃度處理的防效與噁霉靈防效無顯著性差異，但低濃度防效較差。因此，采用芽孢桿菌進行豇豆根腐病防治時，應提高使用濃度。