兩種方法處理冷凝標本的結果分析

洪華林 ，嚴莉 ，沈燕

（1.長興縣中醫院，浙江 湖州 313100；2.浙江省人民醫院，浙江 杭州 310014）

在實際工作中，影響血細胞分析儀檢測結果準確性的因素始終存在，包括儀器、試劑、環境溫度、人為因素、病理因素以及規章制度等[1]。比如冷凝集樣本對血細胞分析儀的檢測參數、散點圖和直方圖均有明顯干擾，導致多項檢測結果與真實結果并不相符，解決冷凝集對全自動血細胞分析儀檢測結果的影響以往多使用水浴法[2-4]，但當含有高效價冷凝集素的標本時，水浴法往往不能有效解決此問題。在工作中發現多次使用Sysmex-XS500i稀釋模式加水浴法能更快、更好地處理高效價凝集標本，現對直接水浴儀器法測定結果與預稀釋再水浴儀器法作比較，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 1例于2018年3月20日夜間因急性呼吸道感染到長興縣中醫院就診患者，男，65歲。血常規檢查：RBC 為 1.18×1012/L，HGB 為 131g/L，WBC 為 9.92×109/L，PLT 為 199×109/L，血細胞比容（Hct）為 12.3%，紅細胞平均容積（MCV）104.2fL，紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）為110.0pg，紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）為1065g/L。急診Sysmex-XS500i血細胞分析儀報警提示紅細胞雙峰、紅細胞凝集。肉眼可見抗凝管內壁有較多凝集顆粒，呈磨砂狀，標本制作血涂片，瑞-姬氏染色發現RBC大量聚集成塊。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 日本Sysmex-XS500i全自動血液分析儀及其配套試劑和校準物以及國產質控品，上海博迅HHS型電熱恒溫水浴箱，奧林巴斯CX31雙目顯微鏡。

1.2.2 檢測方法 分析前Sysmex-XS500i高、低兩個水平的室內質控，質控品來源于山東煙臺卓越生物科技有限公司。將用EDTA-K2抗凝的急診冷凝集標本分為2等份。其中一份標本分成10小等份，不做稀釋處理，放入37℃水浴箱溫育不同時間后立即用Sysmex-XS500i檢測2次，結果取平均值；另一份標本按Sysmex-XS500i稀釋模式1:7比例稀釋處理，再分成10等份，同樣放入37℃水浴箱溫育不同時間后立即用Sysmex-XS500i稀釋模塊同樣檢測2次，結果取平均值。儀器檢測前肉眼觀察20份標本，完成檢測后立即制作血涂片，瑞-姬氏染色觀察紅細胞聚集情況。

1.3 統計學處理 以《WS/T406-2012臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》中的比對試驗接受標準作為判斷差異大小的標準，比較直接水浴儀器法與預稀釋再水浴儀器法測定結果的差異。

2 結果

2.1 儀器檢測 從表1中可知：（1）兩種方法處理后水浴相同時間內WBC結果差異較明顯（大于規定標準7.5%），同一方法水浴不同時間WBC變化較小（小于規定標準7.5%）；（2）兩種方法處理后水浴相同時間內RBC結果差異較明顯，（大于規定標準3.0%），同一方法水浴不同時間，A組變化較小，B組在水浴5分鐘后變化明顯，兩者隨著水浴時間的延長，RBC計數慢慢增高，與起始水浴的情況相比差異較明顯；（3）HBG無論是不同方法還是不同時間，結果均較穩定（小于規定標準3.5%）；（4）Hct變化與 RBC 相似；（5）MCV 與 HGB 相似；（6）MCH與MCHC變化趨勢大致相同，即兩種方法處理后水浴相同時間內MCH與MCHC結果差異較明顯（大于規定標準3.5%），同一方法水浴不同時間A組變化較小，B組水浴5分鐘后變化明顯，兩者隨著水浴時間的延長，MCH與MCHC呈降低趨勢，與起始水浴的情況相比差異較明顯；（7）PLT經兩種方法處理后水浴相同時間內結果差異較明顯（大于規定標準12.5%），未稀釋水浴法處理標本后，水浴不同時間PLT變化不大（小于規定標準12.5%），而預稀釋水浴法隨著水浴時間延長PLT計數呈升高趨勢，與起始情況相比差異較明顯。

表1 兩種不同方法處理冷凝集標本檢測結果

2.2 肉眼觀察及瑞-姬氏染色鏡檢 肉眼觀察時，直接水浴標本（A組）始終能看到磨砂狀的肉眼凝集（圖1），而預稀釋再水浴標本（B組）一開始有磨砂狀凝集，5分鐘后即消失（圖2）；標本血涂片鏡檢下，A組始終能看到大片聚集現象（圖3）；B組很難觀察到肉眼凝集，血涂片除最初階段有少量凝集之外，后續時間紅細胞聚集少見或者未見（圖4-5）。詳見表2。

3 討論

冷凝集是指由冷凝集素引起的RBC在低溫環境下凝集成團的現象。冷凝集反應一般出現在30℃以下，0～4℃時最強，尤以RBC凝集最為明顯[5]。冷凝集素是一種針對RBC膜抗原的IgM型自身抗體，是一種可逆性抗體，在低溫時可與自身RBC、“O”型RBC發生冷凝集，溫度提高后凝集可消失。健康人血液中可存在低滴度的冷凝集素，其滴度往往在1:16以下[6]，一般不引起RBC凝集，但當冷凝集素滴度明顯增高時，則可引起比較嚴重的RBC凝集。自身免疫性疾病、支原體感染、非特異性炎癥、傳染性單核細胞增多癥及漿細胞瘤等可引起冷凝集素滴度輕度增高（特殊情況下可以明顯增高），而高滴度冷凝集素主要見于原發性冷凝集素綜合征[7]。冷凝集現象會干擾血細胞分析儀檢測，對血常規多項參數造成不同程度的影響。通過對比分析具有冷凝集現象的血標本經過不同處理方式在37℃水浴前、后各參數的檢測結果變化，以RBC、Hct、MCH、MCHC等參數受冷凝集的影響最為敏感，其次為WBC、PLT（造成其結果降低）。冷凝集現象可引起RBC、Hct結果明顯減低，但HGB結果無明顯變化，使RBC、Hct與HGB的關系嚴重不符，造成MCH、MCHC 結果顯著增高[8]。

目前，處理冷凝集的報道多偏向于熱水浴的方法和血漿置換法。但血漿置換法操作比較繁瑣，且操作過程中會造成WBC、PLT有所減少，需要手工校正[7]。本研究建議對水浴法不能完全消除干擾的冷凝集標本，可采用預稀釋水浴法，并用Sysmex-XS500i稀釋模塊檢測。本實驗結果顯示，經過以上方法，WBC、RBC、Hct、MCH、MCHC、PLT 與未稀釋水浴結果比較偏倚分別大于7.5%、3.0%、3.5%、3.5%、3.5%、12.5%，效果明顯，而且操作方便，在預稀釋水浴25～30分鐘后各參數趨于穩定。主要原因在于1:7稀釋標本時，降低了標本的凝集效價，增加了細胞間的距離，降低了細胞表面電荷的作用，從而減少細胞間的聚集，降低冷凝集素的干擾[7]。涂片顯微鏡下觀察顯示，紅細胞無凝集現象，上機檢測時血常規各項參數檢測結果均恢復正常，直方圖恢復正常，Sysmex-XS500i無報警提示。王加勇等[9]研究過使用血液分析儀Sysmex-XN9000預稀釋再水浴處理冷凝集標本，效果顯著，符合美國實驗室修正法規（CLIA’88）規定的室間質量評價要求。需要注意的是，稀釋時比例必須嚴格按照稀釋模式比例進行，并選擇良好的量具，否則會造成較大誤差。

綜上所述，對懷疑有冷凝集的標本，上機檢測前應仔細觀察每份血常規標本的外觀，當搖動血液時，觀察到管壁上有明顯的磨砂狀的凝集顆粒應將血標本預稀釋置37℃水浴25～30分鐘，待冷凝集現象消除后，立即上機檢測。因此，在日常工作中要自覺地按實驗要求對每份血細胞檢測結果仔細分析，在審核報告單時，除了重點審查WBC、RBC、HGB、PLT等主要指標外，還需核對MCH、MCHC等指標，當MCH與MCHC明顯增高時，且觀察到散點圖、直方圖異常及儀器報警提示，往往表示有冷凝集現象。如發現冷凝集標本，應密切結合臨床，查明原因，通過預稀釋37℃水浴25～30分鐘等方法排除干擾，防止檢驗報告錯誤，影響臨床診療。