血清miRNA-21、Smad1聯合尿NGAL檢測對早期糖尿病腎病的診斷價值

王錢虎，陳鋰，彭亮

（杭州市第一人民醫院，浙江 杭州 310006）

早期糖尿病腎病癥狀不明顯，進展緩慢，缺乏明確的診斷指標，發現并采取積極的治療有助于延緩甚至阻止病程進展，對逆轉或延緩腎功能損害具有重要意義[1-2]。血清miRNA-21參與血管內皮細胞功能變化，miRNA-21表達下調與糖尿病腎病的發生及進展密切相關[3]。人信號轉導分子1（Smad1）為腎臟功能紊亂的標志物之一，其水平與腎小球系膜基質積聚程度呈正相關，可用于評價糖尿病腎病的嚴重程度[4]。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）是腎臟保護性蛋白，參與多種腎臟疾病的發生發展，是反映急性腎損傷的有效指標，能夠反映腎小管功能[5]。本研究旨在探討血清miRNA-21、Smad1聯合尿NGAL檢測對早期糖尿病腎病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月-2016年12月本院收治的130例糖尿病患者（糖尿病組），所有患者均符合2010年糖尿病的診斷標準[6]，餐后血糖＞11.1mmol/L，空腹血糖＞7.0mmol/L，糖化血紅蛋白＞9.0%。選擇同期210例早期糖尿病腎病患者（早期糖尿病腎病組），所有患者均符合糖尿病早期腎病的診斷標準[7]，尿白蛋白排泄率20～200μg/min。排除標準：（1）有內分泌、心血管、泌尿系統免疫性疾病患者；（2）原發性腎病、腎動脈狹窄，以及心臟、肝臟及其他全身疾病所致的腎臟疾病患者。兩組一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 所有患者均于早晨空腹抽取肘靜脈血3mL置于干燥試管中，室溫3000r/min離心10分鐘，取上清液，-80℃凍存備用。采用聚合酶鏈反應（PCR）檢測血清 miRNA-21，Trizol提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取血清總RNA，按照mRNA逆轉錄試劑盒 （上海生工生物工程有限公司）說明書進行逆轉錄反應，95℃變性，60℃退火，40個循環。計3個復孔，以重水為陰性對照。根據標準曲線及待測樣本二階導數最大分析法計算的Ct值計算miRNA-21水平。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）定量測定血清Smad1水平，嚴格按照試劑盒（南京建成生物科技有限公司）說明書操作。留取清晨中段尿5mL，室溫3000r/min離心10分鐘，取上清，-80℃凍存備用。采用ELISA法檢測尿NGAL水平，嚴格按照試劑盒（福建邁新生物技術有限公司）說明書操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料以百分率表示，并采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本或配對資料t檢驗，采用Pearson進行相關分析，用ROC曲線分析篩選敏感度和特異度。

2 結果

2.1 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL水平 早期糖尿病腎病組血清miRNA-21含量顯著低于糖尿病組，血清Smad1和尿NGAL水平顯著高于糖尿病組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。詳見表2。

2.2 ROC曲線分析 以靈敏度為縱坐標，1-特異度為橫坐標，繪制早期糖尿病腎病患者ROC曲線。血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL的靈敏度、特異性、陽性似然比、尤登指數顯著低于三者聯合檢測，差異有統計學意義（P＜0.05）。 血清 miRNA-21、Smad1、尿NGAL的陰性似然比顯著高于三者聯合，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1和表3。

表2 兩組血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比較（±s）

表2 兩組血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比較（±s）

與糖尿病組比較**P＜0.01

尿N G A L（μ g/L）糖尿病組 1 3 0 9 7.2 4±8.3 7 0.6 9±0.1 7 1 6.5 2±5.2 6組別 n m i R N A-2 1（%）S m a d 1（n g/m L）早期糖尿病腎病組 2 1 0 7 2.1 5±6.4 2** 1.0 4±0.2 1** 5 9.4 7±9.6 8**

2.3 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL相關性分析 早期糖尿病腎病患者血清miRNA-21和Smad1、尿 NGAL 呈負相關（r=-0.683，r=-0.714，均P＜0.05）；血清Smad1和尿 NGAL呈正相關（r=0.806，P＜0.05）。

表3 血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL和三項聯合的診斷效能

3 討論

糖尿病是臨床上常見的內分泌代謝性疾病，機體高血糖的狀態下內皮細胞釋放大量內皮血管活性物質，造成腎小球及毛細血管硬化，加快非酶促糖基化，導致糖尿病腎病[8]。糖尿病腎病為糖尿病嚴重微血管并發癥，是導致死亡的主要原因。早期糖尿病腎病癥狀隱匿，難以確診。目前早期糖尿病腎病診斷主要依靠微量尿蛋白，但易受多種因素影響，對腎損傷程度缺乏差異性，腎活檢為診斷早期腎病的金標準，但其具有創性[9]。尋找早期糖尿病腎病敏感、特異、無創性指標對于確診和指導早期干預具有重要意義。

miRNA在糖尿病發生發展中具有重要作用，miRNA-21為可抑制靶基因轉錄，其表達不受重蛋白編碼啟動子調控，其血清含量在糖尿病腎病患者中的表達與病情嚴重程度有關[10]。Smad1可上調Ⅳ型膠原表達，活化腎小球硬化分子，其表達與白蛋白尿水平無關，與早期系膜基質的積聚密切相關，是糖尿病腎病早期診斷的新型生物指標[11]。NGAL為脂質運載蛋白，參與免疫應答、脂質代謝、細胞分化凋亡等過程，可通過介導鐵離子轉運，促進原始腎小管上皮細胞發育，當腎組織受到損害后促進腎小管的形態及功能的恢復，參與多種腎臟疾病發生發展過程[12-13]。血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL雖均與糖尿病腎病有關，但其在早期糖尿病腎病的含量和表達尚缺乏研究。

本研究發現，早期糖尿病腎病組血清miRNA-21含量顯著低于糖尿病組，而血清Smad1和尿NGAL水平顯著高于糖尿病組，且血清miRNA-21和Smad1、尿NGAL呈負相關，血清Smad1和尿NGAL 呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。ROC曲線顯示血清miRNA-21、Smad1聯合尿NGAL檢測優于單個指標，差異有統計學意義（P＜0.05）。早期糖尿病腎病患者腎小管上皮細胞NGAL高表達，且NGAL先于尿微量白蛋白反映腎功能損傷，早期腎小管損害即可引起血清Smad1的高表達，患者全身氧化應激狀態導致病情的進展，損傷腎小球和內皮細胞功能，加重病情，導致血清miRNA-21含量降低，表達下調。

血清miRNA-21、Smad1聯合尿NGAL檢測早期糖尿病腎病具有較高的診斷效能，有望成為早期糖尿病腎病的診斷指標。但本研究沒有與微量尿蛋白這一指標進行比較，需進一步進行探討。