Hedgehog信號通路在人牙周膜干細胞應力成骨中的作用及轉導機制

張潔

（杭州市兒童醫院，浙江 杭州 310014）

矯治性牙位移動過程中，牙槽骨的應力改建主要是以破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成相互協調的結果。其中張應力區中所發生的由成骨細胞介導的骨形成是錯位牙矯治性定向移動中安全和穩定的根本保證。因此，研究牙槽骨應力條件下的分子機制對刺激應力成骨的骨形成選擇高效的外源性途徑，具有重要的臨床意義。

人牙周膜干細胞 （Human periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是正畸牙移動過程中骨改建的關鍵細胞。Hedgehog（刺猬基因，Hh）信號通路在骨發育和成骨分化中具有重要作用[1]。而近年來研究提示，Hedgehog信號通路促進了PDLSCs的增殖過程[2]。前期研究發現，Hedgehog信號通路參與了PDLSCs應力成骨過程[3]。本實驗利用FX-4000T細胞加力裝置，模擬PDLSCs應力成骨的體外環境，通過分子生物學方法探討Hedgehog信號通路在PDLSCs應力成骨過程中的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞培養基α-MEM （Alpha minimal essential medium，α-最低必須培養基）及優等胎牛血清、293FT細胞株均購自Invitrogen公司；慢病毒載體pGreenPuro購自Systembio公司；限制性內切酶、PCR試劑盒購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自Omega公司；SMO（Smoothened，原癌基因，sc-6366）、Gli-1（Glioma associated oncogene family zine finger，神經膠質瘤相關致癌基因家族鋅指，sc-20687）、Patch1（Ptched，腫瘤抑制物，sc-9672）、Runx 2（Runt-related transcription factor 2， 核心結合因子，sc-101145）、ALP （Alkaline phosphatase，堿性磷酸酶，sc-79839）抗體均購自Santa cruz。采用FX-4000T應力加載系統（Flexcell International Corporation，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養與鑒定 取12-15歲因正畸需要或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，用1%雙抗PBS反復沖洗，冠根單向刮取牙根中1／3的牙周膜，采用酶消化組織塊法聯合培養，48小時后首次換液，之后每3天換液，細胞融合至80%時傳代，采用間充質干細胞標記蛋白（Stromal cell antigen，STRO-1） 抗體通過流式細胞儀細胞分選的方法獲得第三代PDLSCs。

1.2.2 SMO siRNA慢病毒表達載體的構建、篩選及鑒定 根據GenBank人SMO基因（NM-005631），按照RNA干擾序列確定干擾靶點。將合成的干擾序列退火后連入BamH I和EcoR I酶切后的載體pGreenPuro中，構建質粒通過DNA測序驗證。將對照載體及干擾載體包裝病毒，轉染293A細胞，篩選后收集細胞，通過定量PCR檢測SMO基因的表達。取第3代PDLSCs進行病毒轉染，轉染效率為80%。熒光顯微鏡觀察轉染組（pGP-SMO1）、對照組（Control）細胞綠色熒光蛋白表達情況。Western印跡法檢測各組在感染48小時后蛋白水平的表達。

1.2.3 細胞加載 通過國際標準化水平的加力裝置FX-4000T對PDLSCs進行應力加載實驗。將第4-6代PDLSCs的三組細胞（慢病毒干擾組PDLSCs/SMO-RNAi、空慢病毒感染組 PDLSCs/vector、正常細胞對照組PDLSCs/wt）分別種于BioFlex培養板內，繼續培養12小時后，加載動態張應力。設置加載的方式為最大型變量12%，最小型變量0的正弦波，頻率 0.1Hz，加力時間為 0、6、12、24 小時。 加力結束后分別提取各組細胞的蛋白質做后續檢測。

1.2.4 Western印跡法檢測提取樣品中ALP、Runx2、Gli-1、Patch1、SMO 蛋白的表達 BCA 法蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。各組分別取蛋白150g上樣，經10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉入PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2小時。加入一抗，4℃冰箱過夜，TBST洗膜4次后加入二抗，室溫下輕搖半小時。TBST洗膜4次后，ECL工作液顯影。將同一電泳所獲得的ALP、Runx2、SMO與內參GAPDH的條帶灰度值相比，得到各組樣本目的蛋白灰度比值。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計。計量數據采用（±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 PDLSCs的分離培養 采用酶消化組織塊法聯合培養，48小時后可見部分組織塊周邊有細胞爬出，細胞形態呈梭形或不規則形，有2-4個凸起。詳見圖1。

2.2 PDLSCs的鑒定 流式細胞儀分選出的STRO-1陽性細胞經培養可見其形態與PDLCs形態相似，體積略小，多為漩渦狀排列。詳見圖2。

2.3 流式細胞術表型分析 單標STRO-1陽性率為83.3%，單標CD146陽性率為89.9%，STRO-1和CD146雙標陽性率為87%，說明所得細胞表達間充質干細胞早期標志物[4]。

2.4 PDLSCs中SMO基因干擾 轉染培養的PDLSCs 48小時后熒光顯微鏡觀察可見有較高的轉染效率以及較強的熒光表達（圖3），證明干擾病毒能有效地轉染PDLSCs。收集細胞提取總蛋白進行Western印跡法檢測SMO蛋白表達量，以GAPDH為內參，顯示慢病毒干擾載體能夠在蛋白水平有效地下調目的基因的表達（圖4），表達量降低80%（干擾組灰度值0.22±0.04，對照組灰度值1.15±0.13，P＜0.01）。 說明本實驗成功構建了能夠在PDLSCs中下調SMO基因表達的病毒。

2.5 PDLSCs應力成骨過程中各實驗指標 Western印跡法測得各組 ALP、Runx2、Gli-1、Patch1、SMO 的結果及IOD值，詳見圖5-7、表1。其中PDLSCs/vector組與PDLSCs/wt組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 成骨及Hh相關標志物的IOD值

3 討論

矯治性牙位移動過程中骨改建的生物學基礎在于適宜的力學刺激調節細胞的新陳代謝和基因表達，從而調控骨組織的形成和改建[5]。加速骨改建的生物學進程，縮短矯治性牙位移動的時間，對臨床治療有重要的指導意義。研究證實，牙周膜干細胞是正畸牙移動過程中應力作用的靶細胞，力學刺激作用于該細胞，通過胞外基質傳導至胞漿引起一系列細胞內的生物學變化，從而觸發牙槽骨的應力改建，最終實現了牙齒的定向移動[6]。這種將機械信號的刺激轉化為生物反應的過程是通過一定的信號通路傳導產生的。前期研究發現：與力學及成骨分化有關的Hedgehog（Hh）信號通路參與了人牙周膜干細胞的應力成骨過程，但調控機制尚不明了。

Hh信號通路包含Ptch、SMO及通路下游GLI等多種蛋白。在沒有Hh配體的作用下，Ptch與SMO結合，抑制了SMO的活性，轉錄因子Gli的活性也受到抑制，此時通路處于失活狀態，而當存在Hh配體時，Hh編碼的蛋白會與Ptch受體結合，從而解除對SMO的抑制作用，SMO將Hh信號向細胞質傳遞，激活轉錄因子Gli入核，并激活Hh靶基因的表達[7-8]。SMO作為Hedgehog信號通路中最重要的信息轉換器，負責Hh的信號傳導，激活SMO即可導致Hedgehog靶基因的活化，繼而控制細胞基本活動進程和方向[9]。因此，調節該分子的表達情況，闡明Hedgehog信號通路在PDLSCs受應力刺激下的作用，對于研究分析PDLSCs應力成骨的分子機制具有重要意義。

本實驗利用RNAi成功抑制了SMO的表達后，比較實驗組和對照組相關蛋白的表達情況：Runx2和ALP的蛋白表達水平明顯降低，表明抑制Hh信號通路可以降低應力成骨中PDLSCs的骨向分化及成骨，提示Hh信號通路在應力成骨過程中具有調控作用，從分子水平解釋了“Hh信號通路在將胞外的張應力刺激轉化為胞內生化信號的過程中可能扮演重要角色”的結論。同時，Runx 2和ALP的蛋白表達水平在加力早期（0～6小時）時明顯降低，隨著加力時間的延長（6～12小時）表達仍有升高趨勢，說明Hedgehog信號通路在PDLSCs應力成骨過程中的調控作用主要體現在分化的早期，這與Cho等[10]的研究結果不謀而合。此外，兩組PDLSCs的Runx 2和ALP表達量均在應力作用12小時升高明顯，說明應力刺激12小時具有較強的促成骨分化作用，這對后續實驗加力時間點的選擇有一定的指導意義。

綜上，通過RNAi來抑制Hedgehog信號通路中核心分子SMO，從分子水平調控和干預PDLSCs應力成骨的過程，深入研究Hedgehog信號通路在PDLSCs應力成骨過程中的作用及分子機制，為提高矯治性牙位移動過程中牙槽骨的成骨效率提供了新的思路和途徑。