TB-RNA和Gen-Xpert MTB/RIF檢測在糖尿病并發肺結核中的診斷價值研究

劉 莉，周 祎， 張 寧， 甘昭平

陜西省結核病防治院(西安 710100)

主題詞 糖尿病/并發癥 結核，肺/診斷 @TB-RNA @Gen-Xpert MTB/RIF

近幾十年來，全球糖尿病患者的數量迅速增長，糖尿病并發肺結核的危險度為普通人的3倍以上，有研究結果顯示5%～30%的糖尿病患者并發肺結核[1]。糖尿病并發肺結核患者常具有病情進展快 、治療難度大、治療效果差 、結核復發率高 、患者病死率高等臨床特點，有報道稱糖尿病可能是將來威脅結核病控制的主要因素[2-3]。因此早發現、早診斷、早治療對糖尿病并發結核病至關重要。目前分子生物學技術進入結核病領域，基因診斷方法大大提高了結核病的診斷。本研究對診斷為糖尿病并發肺結核患者的痰樣本分別采用TB-RNA、Gen-Xpert MTB/RIF、傳統的痰涂片抗酸染色鏡檢及MGIT 960進行檢測，結果并進行對比分析，評價TB-RNA、Gen-Xpert MTB/RIF系統對糖尿病并發肺結核的診斷價值 。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年7月1日至2017年8月31日陜西省結核病防治院收治的確診的糖尿病并發肺結核患者共131例，其中男102例，女29例，年齡15～83歲，平均年齡(57.02±12.9)歲。肺結核診斷符合國家衛計委發布的《新版肺結核的分類及診斷標準(2018年版)》[4]菌陰性肺結核：①符合典型肺結核臨床表現和胸部X線表現；②抗結核治療有效；③臨床可排除其他非結核性肺部疾患；④PPD(5IU)強陽性，血清結核抗體陽性；⑤痰結核菌PCR和探針檢測呈陽性；⑥肺外組織病理證實結核病變；⑦支氣管肺泡灌洗液中檢出抗酸分枝桿菌；⑧支氣管或肺部組織病理證實結核病變。具備①～⑥中3項或⑦～⑧中任何1項可確診。確診病例：①涂片查抗酸桿菌：2次痰查抗酸桿菌陽性；或1次痰查抗酸桿菌陽性，同時1次痰結核分枝桿菌培養陽性；或1次抗酸桿菌陽性，同時影像學符合肺結核表現；②痰培養：影像學支持肺結核，同時結核分枝桿菌培養陽性，即可確診；③分子生物學檢查：影像學支持肺結核，同時結核分枝桿菌核酸檢測陽性，即可確診；④病理：影像學支持肺結核，同時病理檢查支持肺結核，即可確診。糖尿病診斷符合《2012年糖尿病診療指南》的糖尿病診斷標準(美國糖尿病學會(ADA))[5]：典型糖尿病癥狀(多飲、多尿、多食、體重下降)+①隨機血漿葡糖糖水平≥11.1mmol/L(200mg/dl)或②空腹血漿葡糖糖(FPG)水平≥7.0mmol/L(126mg/dl)或OGTT 2h后血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。如無糖尿病癥狀，應重復上述檢查。

2 研究方法

2.1 標本采集：在抗結核藥物應用前收集糖尿病并發肺結核患者的即時痰液標本：患者使用清水漱口2次，深吸氣用力從肺部深處咳出痰，收集于無菌痰瓶中，擰緊瓶蓋，于2～8℃保存樣本，以備送檢。

2.2 儀器與試劑：痰結核菌培養的BACTEC MGIT 960系統，MGIT管、RIF藥粉均來自于美國BD公司?？顾釛U菌染色液由珠海貝索生物技術有限公司提供；結核分枝桿菌鑒定試劑盒(膠體金法)由杭州新創生物檢控技術有限公司提供，Gen-Xpert MTB/RIF檢測方法及試劑盒來自于美國Cepheid公司。TB-RNA核酸檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司生產。

2.3 檢測方法：收集我院糖尿病并發肺結核住院患者的痰液，同時進行涂片抗酸染色實驗、MGIT 960、TB-RNA檢測、Gen-Xpert MTB/RIF檢測。

2.4 抗酸桿菌涂片：將5ml痰標本等量加入84消毒液，消化5～10min(不斷混勻)，倒入試管內加蒸餾水至10ml混勻，3000r/min離心10min，取出倒棄上清液，取沉淀物0.5ml，進行抗酸桿菌染色。使用光學顯微鏡觀察染色，抗酸桿菌個數≥3個/100視野則認定為陽性結果。

2.5 MGIT 960培養：對所有無菌采集的標本按儀器、試劑操作要求接種于MGIT管后，放入BACTEC 960系統儀器進行培養，出現陽性結果后，取培養液進行抗酸染色，如果染色陽性，對此培養液再進行結核分枝桿菌菌型鑒定，鑒定為結核分枝桿菌后，再進行藥敏試驗。

2.6 TB-RNA檢測：根據試劑盒說明書進行操作，將液化好的標本按 1∶100的比例稀釋，用超聲波清洗儀進行超聲處理 15min (功率 300W)。超聲處理結束后，取2μl處理后的標本加入30μl擴增檢測液，啟動恒溫熒光檢測儀器，按儀器操作說明設定反應程序，熒光素通道設定為6-羧基熒光素 (FAM)42℃1min，40個循環，每分鐘收集1次熒光信號，共檢測 40次。反應結束后置于恒溫混勻儀上42℃保溫 5min：同時將酶液預熱到42℃加入反應管，快速轉至恒溫熒光檢測儀上進行檢測。

2.7 Gen-Xpert MTB/RIF檢測：按照儀器、試劑操作說明書對標本進行加工處理，取2ml加入反應盒中，再將反應盒放入檢測模塊儀器中進行檢測，反應結束后，在檢測系統窗口下觀察檢測結果，系統報告為錯誤、無效的結果不納入結果統計。

3 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件對數據進行統計處理，計數資料的比較采用χ2檢驗。以MGIT 960陽性為金標準，計算抗酸染色法、TB-RNA、Gen-Xpert MTB/RIF 檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致性等。三種檢測方法的一致性采用一致性檢驗，用Kappa(K)值表示，K值>0.75認為一致性好，0.4

結 果

表1 以MGIT 960為金標準比較抗酸染色法、TB-RNA、Gen-Xpert MTB/RIF 檢測痰標本的效能

注：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)

圖1 以MGIT 960為金標準的抗酸染色法、TB-RNA、Gen-XpertMTB/RIF 檢測ROC曲線下面積

中國糖尿病患者數量位于世界前列，2015年糖尿病患者總數1.09億，而糖尿病并發肺結核已成為臨床常見病[1-2]。早發現、早診斷、早治療糖尿病并發肺結核患者，對控制結核病的疫情意義重大。近年來，分子生物學技術運用于結核病的診斷，其中RNA恒溫擴增實時檢測技術用于檢測是否存在結核分枝桿菌的感染，也可以區別活菌和死菌，因為這項技術用于判斷結核菌是否活動及抗結核治療后效果的判定，有利的提高了肺結核患者的診斷率[6-7]。Gen-Xpert MTB/RIF檢測是以半巢式實時熒光PCR檢測技術為基礎，是以rpoB基因利福平耐藥決定區(RRDR)81bp核心區為靶序列，使MTB檢出和利福平的耐藥性的時間縮短到2.5h內，大大縮短了結核疑似患者診斷時間，對實驗環境要求不高，易于操作，目前臨床已經廣泛使用[8]。

本研究納入131例確診糖尿病并發肺結核患者，Gen-Xpert MTB/RIF陽性率為60.31%，BACTEC MGIT 960液體培養(陽性率57.25%)，TB-RNA(陽性率為52.25%)，涂片抗酸染色(陽性率為37.40%)。Gen-Xpert MTB/RIF陽性率明顯高于 MGIT 960、TB-RNA、涂片抗酸染色，相比較差異有統計學意義(χ2=16.268，P=0.000)。這一結果符合國內報道，糖尿病并發肺結核患者的痰菌陽性率在50%～78.4%，遠高于單純肺結核患者，說明雙重疾病的患者更具有傳染性[9-11]，TB-RNA的陽性率雖較Gen-Xpert MTB/RIF、MGIT 960略低，但它可以快速檢測出是否有活菌存在，大大縮短了活動性糖尿病并發肺結核患者的診斷時間。

Gen-Xpert MTB/RIF檢測方法是近幾年快速發展的基因診斷技術，與傳統檢測方法比較，敏感度和特異度均明顯升高。有研究報告痰液Gen-Xpert MTB/RIF對涂陽肺結核診斷敏感度是95.2%～95.7%，涂陰肺結核的診斷敏感度是48.6%～77.7%，兩者的特異度均在96%以上[12]。本研究結果顯示以MGIT 960為金標準，Gen-Xpert MTB/RIF的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別是97.33%、89.29%、92.41%、96.15%。曲線下面積最大為0.933，且與MGIT 960一致性較好(K=0.874)。這與劉旭輝等[13]的研究結果一致。Gen-Xpert MTB /RIF敏感度84.7%，特異度65.5%，陽性預測值93.9% ，陰性預測值40.4% 顯著高于結核菌培養和結核菌涂片，這種方法可以提高糖尿病合并肺結核的診斷率。

文獻報道[6，14]TB-RNA檢測技術，具有檢測時間短，敏感性高，特異度和陽性率均較傳統檢測方法高，且可以區分死菌和活菌，與結核分枝桿菌培養一致性良好。本研究結果顯示，以MGIT 960為金標準，TB-RNA敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別是81.33%、85.71%、88.41%、77.42%，曲線下面積最大為0.853，且與MGIT 960一致性中等(K=0.670)。高于任斐等[14]曾報道的支氣管灌洗液TB-RNA的敏感度53.7%，這與吳璇等[15]報道，肺泡灌洗液TB-RNA的敏感度78.33%、特異度83.93%、陽性預測值83.93%和陰性預測值78.33%相似。MGIT 960培養和TB-RNA陽性提示活菌的存在，本研究結果在19例涂陽培陰患者中，16例RNA陰性，說明RNA與結核菌培養基本一致，可以區分死菌與活菌，可用于臨床抗結核治療后療效的判斷。

Gen-Xpert MTB/RIF和TB-RNA檢測與傳統檢測方法比較，具有快速、高效等特點，TB-RNA檢測還可以區別死菌和活菌，在臨床工作中，我們把TB-RNA和Gen-XpertMTB/RIF檢測相結合，可以提高肺結核以及糖尿病并發肺結核患者的診斷，也有利于治療后效果判定。