2型糖尿病患者C11orf 65基因rs11212617位點多態性與二甲雙胍臨床療效相關性研究*

鐘春元，陳祚和，邱成旭，楊守東

1.江西省興國縣人民醫院(興國 342400)，2.內蒙古包鋼醫院藥劑科(包頭014010)

主題詞 @C11orf 65基因 糖尿病，2型/免疫學 二甲雙胍 多態現象，遺傳學

我國的患者人群中，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為威脅人民健康的重大慢性病，二甲雙胍在2型糖尿病的治療中具有舉足輕重的地位，它不但能夠增強機體對胰島素的敏感性，而且能夠降低肝糖原的分解、增強肝臟對葡萄糖的吸收，是目前在全世界的口服降糖藥物當中應用最廣泛的[1]。但是，即便在患者依從性良好的情況下，臨床中也能觀測到降糖療效存在著較大的個體差異。有研究發現，在規范使用二甲雙胍的患者中，約有30%的患者降糖患者并不理想[2]。有文獻報道C11orf 65基因多態性與二甲雙胍的降糖效果具有顯著的相關性[3-4]，但上述研究均在白種患者人群中展開，未在中國人群中得到相關驗證。因此，本研究旨在探索就診于我院的T2DM患者中，其C11orf 65基因rs11212617位點的多態性與二甲雙胍的臨床降糖效果之間的相關性，為臨床中二甲雙胍的使用提供借鑒。

資料與方法

1 一般資料 選擇2015年1月至2017年12月就診于我院的新發T2DM患者，納入標準依據1999年WHO糖尿病診斷標準診斷為T2DM，要求納組的T2DM患者接受二甲雙胍的單藥治療，而且要保證在后來的12個月內接受臨床的隨訪要求。最終入組180例患者，其中男性100例，女性80例，平均年齡(61.2±9.2)歲，患者的個體之間無任何親緣關系。排除標準如下：1型糖尿病患者除外；遺傳性糖尿病患者除外；已經出現了糖尿病的并發癥患者除外；患有心腦血管疾病的患者除外；肝腎功能異常的患者除外；正在服用除二甲雙胍外的其它降糖藥物(中藥或其它降糖機制的化學藥物)的患者要剔除；在使用二甲雙胍的過程中，如果患者出現了嚴重的不良反應或藥物過敏，應從研究中剔除。納入的所有患者或其家屬均要簽署知情同意書。

在患者服用二甲雙胍之前以及12個月的隨訪結束的時候，對患者的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平進行檢測，依據各患者的HbA1c水平變化幅度，評價不同C11orf 65基因型的患者二甲雙胍的降糖療效。

2 血樣收集與DNA的提取 患者的基因型不會改變，在任意時間均可采集外周血，采血量約于2ml，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，離心分離血漿及血細胞。采用市售試劑盒提取基因組DNA(胍鹽酸法)，置于-20℃冰箱中備用。

3 引物、PCR擴增及基因分型 采用聚合酶鏈擴增反應-限制性長度片段多態性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術分析C11orf 65(rs11212617 C>A)的基因型，上下游引物分別如下：

上游引物：5’-TCCGAGTTTGGCCCTAGCGTCG-3’；

下游引物：5’-GACCATGGACAGCCACACTGAA-3’。

采用Amp 9700 PCR系統(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA，Perkin Elmer基因)對擴增過程進行控制。PCR的擴增條件：95℃ 進行10 min的預變性，95℃進行30s的變性， 58℃進行30s的退火，72℃進行30s的延伸，共進行30個循環，最后72℃下10 min結束本反應。PCR的產物采用限制性的內切酶Taq I (New England Biolabs, Massachusetts, USA)進行酶切。212bp的擴增子酶切以后可得到26bp和186bp片段的，即為位點rs11212617的CC基因型，AA基因型能夠保持在212bp，擴增子經酶切后會得到26bp、186bp與212bp三個片段的則為雜合基因型CA，根據條帶長短與數量確定患者最終的基因分型。為了驗證本方法的準確性，我們隨機選取了樣本采用直接測序的方法進行驗證，最終基因分型的成功率是>98.9%的，對重復樣本的基因分型結果中沒有發現錯誤的情況。

結 果

1 C11orf 65基因的多態性分布頻率 入組的T2DM患者中C11orf 65 rs11212617等位基因頻率為65.0%。C11orf 65 rs11212617基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.16)，這表明了本研究人群C11orf 65 rs11212617基因型分布符合遺傳平衡，入組的患者人群具有很好的代表性。見表1。

表1 T2DM患者中C11orf 65 rs11212617各基因型頻率[例(%)]

2 C11orf 65 rs11212617對二甲雙胍降糖療效的影響 根據C11orf 65 rs11212617不同的基因型(CC、CA、AA)將180例入組患者分為CC型、AA型和AA型三個組別。三種不同基因型攜帶者單用二甲雙胍后HbA1c變化情況有統計學差異。攜帶C11orf 65 CC基因型患者接受二甲雙胍單藥治療12個月以后，HbA1c的下降幅度是(2.69±1.00)%，與AA基因型患者(0.99±0.69)%(P<0.001)和CA基因型患者(1.42±1.22)%比較具有統計學差異(P<0.001)。

3 不同基因型的分組結果比較 A位點若為純合突變時，HbA1c的下降幅度最小，CA基因型與CC基因型患者之間的HbA1c下降差異也存在統計學的意義(P=0.00246)。單藥治療12個月以后，CC、CA和AA這三種基因型的患者HbA1c水平變化見表2。二甲雙胍臨床降糖療效與C11orf 65不同基因型之間的相關性分析見表3。

表2 C11orf 65 rs11212617基因多態性與二甲雙胍單藥療效的相關性分析(n=180)

注：12月HbA1c 代表治療并隨訪12個月后測量的指標；△表示指標經12個月治療后的變化程度

表3 C11orf 65 rs11212617不同基因型與二甲雙胍臨床療效的相關性分析

討 論

除著我國經濟的發展與人民生活水平的提高，近年來糖尿病已經嚴重威脅到了我國居民的健康水平，且糖尿病的患病率也顯著的增加，自1980到2013年間，患病率已經從0.67%上升到了10.4%。最常見的便為T2DM[5]。在T2DM的治療當中，口服降糖藥物治療是最主要的治療方法。隨著藥品的研發，降糖藥物的種類亦在增加，已經從最開始的雙胍類和磺脲類降糖藥，開發出了多種新型的降糖藥物，如胰島素的增敏劑、α-糖苷酶的抑制劑、二肽基肽酶-4(DPP-4)的抑制劑、GLP-1類似物等不同類型的藥物。但是二甲雙胍依然是單藥治療中的首選，得到了2017年中國T2DM防治指南的推薦，即使是在多次注射胰島素時，對于肥胖的糖尿病患者也可以加用二甲雙胍治療[5]。當前，國內外的處方中二甲雙胍在仍占有很大比例。

但是，二甲雙胍的臨床療效在不同的患者間卻存在著較大的差異。二甲雙胍有一定的親水性，口服后迅速吸收進入血液，并以原型的形式通過腎臟從尿液當中排出來[6]，二甲雙胍在人體的藥物動力學和藥效動力學過程當中有多個不同類型的蛋白直接參與，這些蛋白可能會影響到藥物的吸收、分布以及排泄過程。C11orf 65為11號染色體開放閱讀框65的英文簡寫(Chromosome 11 open reading frame 65)，這是一個蛋白編碼基因，已知對T細胞造血干細胞白血病相關。目前國際上僅有三篇文章報道了該基因的位點變異與二甲雙胍的臨床療效相關[3]，本研究以中國人群為研究對象，考察該基因的變異對糖尿病患者接受二甲雙胍單藥治療后的HbA1c下降水平，研究結果與國外報道相近，即C11orf 65基因位點發生變異的患者其對二甲雙胍的反應性降低，而野生型患者的臨床效果較好。

誠然，二甲雙胍的降糖療效不僅受單基因的影響，而是受到了多基因的調控，除了本研究檢測的C11orf 65外，還有其它基因的研究報道。眾所周知，啟動子是調整基因表達的重要因子，已有報道發現MATE1基因的啟動子區g.-66T>C變異致使啟動子的活性降低，最終影響了二甲雙胍的降糖療效[6]。此外，OCT(Solute carrier family,SLC22)家族中的OCT1與OCT2(一種轉運蛋白)，分別分布在上皮細胞和腎近端小管基底外側膜中，能夠介導藥物攝入到肝臟和腎小管的上皮細胞[7]，也會影響二甲雙胍的臨床降糖效果。ATM基因是一個與DNA修復有關的重要基因，它的基因變異也可能會影響到二甲雙胍的降糖效果，但目前各項研究仍未得到一致的結論，還需要進一步的深入探索[8]。

綜上所述，C11orf 65基因rs11212617 AA基因型與CA和CC基因型HbA1c在治療前后變化差異具有統計學的意義(P<0.01)。事先對C11orf 65基因rs11212617位點的多態性進行檢測，能夠幫助我們預判二甲雙胍降糖療效，對臨床的安全有效用藥具有一定的參考價值。