A型肉毒素局部注射對兔耳瘢痕增生影響實(shí)驗(yàn)研究*

陶 諫,劉 賓,汪 陽,崔 鑫,韓 悅

西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科(西安710003)

主題詞 瘢痕/病理生理學(xué) 肉毒桿菌毒素類,A型 增生 注射，肌肉內(nèi) 耳部 兔

瘢痕的產(chǎn)生與傷口愈合過程中成纖維細(xì)胞異常增生以及傷口創(chuàng)緣兩側(cè)局部的張力有著密切的關(guān)系。在創(chuàng)面和傷口愈合過程中，異常的成纖維細(xì)胞增生以及周圍肌肉反復(fù)收縮牽拉引起的微創(chuàng)傷可誘發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)的生化代謝過程，導(dǎo)致細(xì)胞外膠原蛋白和黏多糖的過度沉積，從而引起瘢痕的過度增生以及色素沉著[1]。為了減少傷口愈合過程中的瘢痕增生，我們需要在抑制成纖維細(xì)胞異常增生和降低傷口局部張力方面尋找好的解決辦法。

肉毒素A(Botulinum toxins type A,BTXA)作為一種研究和應(yīng)用廣泛的生物制劑，治療范圍已深入臨床各個領(lǐng)域，包括耳鼻喉、神經(jīng)科、疼痛科、整形美容外科等。其化學(xué)去神經(jīng)作用，使肌纖維不能收縮，進(jìn)一步導(dǎo)致肌肉組織變軟萎縮[2]，從而降低創(chuàng)緣兩側(cè)因局部肌肉收縮而產(chǎn)生的張力。近年來，關(guān)于肉毒素A對于瘢痕組織中成纖維細(xì)胞活性抑制作用的研究一直是瘢痕治療領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。本研究的目的是觀察BTXA對于兔耳瘢痕組織中成纖維細(xì)胞活性的影響，以及對于與瘢痕增生密切相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)的關(guān)系。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 10只新西蘭大耳白兔，體重3～3.5 kg，雌性，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。分籠飼養(yǎng)1周后，以3%戊巴比妥1 ml/kg靜脈麻醉，于兔耳腹側(cè)面近、中、遠(yuǎn)端水平的內(nèi)外側(cè)各切除1個(共6個)直徑1 cm的創(chuàng)面，間隔≥1 cm，建立兔耳增生性瘢痕模型。每只兔耳的外側(cè)3個創(chuàng)面為BTXA(蘭州衡力)治療組(T組)，內(nèi)側(cè)3個創(chuàng)面為瘢痕組(S組)，每組60個創(chuàng)面。T組術(shù)后立即于創(chuàng)面周圍皮下注射BTXA(蘭州衡力)，每個創(chuàng)面5 IU。S組在切口相應(yīng)層次注射相同體積生理鹽水，術(shù)后全身應(yīng)用抗生素7 d預(yù)防感染，術(shù)后第2、4、6天予以傷口換藥，大體觀察創(chuàng)面愈合和瘢痕增生情況。術(shù)后28 d時，切取兩組瘢痕組織，并將各組瘢痕組織隨機(jī)三等分，收集標(biāo)本，分別進(jìn)行HE染色、MTT法檢測成纖維細(xì)胞增殖活性和電泳法測定細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 瘢痕形態(tài)大體觀察： 觀察治療組(T組)與瘢痕組(S組)創(chuàng)面上皮化的時間及瘢痕的色澤、 質(zhì)地與充血等情況。

2.2 HE染色及瘢痕增生指數(shù)(Hypertrophic index，HI)的測量：用于HE染色的標(biāo)本采集需包括瘢痕組織周邊5mm的健康皮膚，中性甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精一伊紅染色。150倍顯微鏡下大體觀察細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)排列情況。瘢痕增生指數(shù)的測量：兔耳創(chuàng)面上皮化后，測量瘢痕增生指數(shù)以了解瘢痕增長的趨勢。其方法為：將 Manson 染色的組織切片用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng) (德國Zeiss公司)分別測定創(chuàng)面上皮化后的真皮厚度及鄰近正常組織中的真皮厚度。瘢痕增生指數(shù) =(兔耳腹面創(chuàng)面愈合后的真皮厚度 - 鄰近正常組織中的真皮厚度)/ 鄰近正常組織的真皮厚度。

2.3 MTT法檢測治療組(T組)與瘢痕組(S組)成纖維細(xì)胞增殖活性：酶消化法處理收集的T組及S組瘢痕組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取第3代對數(shù)期細(xì)胞，常規(guī)傳代以細(xì)胞密度約 5×106/ 孔分別接種于 6 塊 96孔培養(yǎng)板中。每孔加入細(xì)胞懸液200 μl,移入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng) 24 h。生長至鋪滿80% 孔底后，取T組6塊96孔培養(yǎng)板，加入4IU/ml的 BTA 100 μl進(jìn)行培養(yǎng)[3]。S組6塊96孔培養(yǎng)板，加入正常的培養(yǎng)液100 μl。以上每個試驗(yàn)濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)對陰性對照孔(PBS液100μl)。12 塊板繼續(xù)培養(yǎng)不同時間(12 h、24 h、36 h)后進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)。先吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 MTT 溶液 20 μl(5mg/ml用PBS稀釋pH=7.4)，37℃、5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加二甲基亞砜(杭州四季青生物有限公司) 150μl，在酶標(biāo)儀內(nèi)振蕩 10 min，于 492 nm 波長處測定各孔吸光度(A值)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次，取平均 A 值。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

2.4 電泳法測定治療組(T組)與對照組(S組)TGF-β1表達(dá)差異：分別收集T組及S組細(xì)胞剛?cè)诤霞叭诤虾?2 d成纖維細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)冷PBS沖洗3次，加0.5%NP-40裂解液，冰浴20 min,將裂解液及刮下的細(xì)胞殘渣移入離心管,12000 r/min離心5 min,取上清液，蛋白定量，分裝，-70 ℃貯存?zhèn)溆谩５鞍着c加樣緩沖液按4∶1混合，100 ℃煮沸5 min，高速離心5 mim，上清加樣，以濃縮膠100V,分離膠160V，電泳90 min，轉(zhuǎn)膜,麗春紅染色1min, TBS.T清洗,5%脫脂奶封閉1h,加一抗室溫1h(TGF-β1 Chemical公司1∶500，); TBS.T清洗;辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶3000)室溫1h;TBS.T清洗，ECL底物發(fā)光。

結(jié) 果

1 瘢痕形態(tài)大體觀察 術(shù)后18 d， 大部分治療組(T組)與瘢痕組(S組)兔耳創(chuàng)面均完全上皮化。術(shù)后第28天，疤痕組(S組)肉眼可見皮膚出現(xiàn)隆起的瘢痕，其逐漸增生變厚、變硬、充血腫脹，顏色為暗紅色。治療組(T組)創(chuàng)面大部未見明顯的隆起性增生瘢痕， 但少部分創(chuàng)面仍可見輕度持續(xù)存在的扁平瘢痕增生。提示治療組與瘢痕組兔耳瘢痕增生差異與BTXA局部注射有關(guān)。

2 光鏡下瘢痕組織學(xué)形態(tài)及瘢痕增生指數(shù) 鏡下見T組瘢痕的表皮增厚，細(xì)胞外基質(zhì)較薄且排列較整齊(圖1)。S組瘢痕皮膚較薄，層次紊亂，可見大量排列致密且紊亂的細(xì)胞外基質(zhì)(紅染) (圖2)。S、T組的瘢痕增生指數(shù)HI分別為2.23±0.27和1.14±0.23，二者比較差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示BTXA局部注射可抑制兔耳瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的過度無序增殖。

3 MTT法測定成纖維細(xì)胞增殖活性 不同時間經(jīng)BTXA作用后治療組(T組)與未經(jīng)BTXA作用的瘢痕組(S組)成纖維細(xì)胞吸光度變化見表1。

注：同一時段相鄰各濃度組間比較，P< 0.05

測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同時間經(jīng)BTXA作用后的成纖維細(xì)胞活性明顯較未治療組降低，提示BTX A可以抑制兔耳瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖活性。

4 治療組(T組)對照組(S組)TGF-β1表達(dá)活性差異 治療組(T組)的TGF-β1條帶明顯小于對照組(S組)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。提示：BTX A可以通過降低兔耳瘢痕組織中成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)而起到抑制瘢痕增生的效果。

圖3 T組及S組成纖維細(xì)胞TGF-β1電泳條帶

手術(shù)或外傷后的瘢痕一直是外科醫(yī)生面臨的難題。臨床上對于瘢痕的治療方法包括激素注射、壓力療法、放射性治療、超聲療法、以及局部應(yīng)用硅酮類藥物等[4]。皮質(zhì)類固醇藥物的局部注射療法目前仍很常見，但遠(yuǎn)期觀察表明，類固醇藥物注射后局部皮膚可能表現(xiàn)為變薄、萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及發(fā)紅，因此仍不能作為理想的抗瘢痕療法。其余方法盡管能部分改善瘢痕狀況，但并不能預(yù)防由于肌肉牽拉所致的瘢痕增寬這一病理過程，因此總的效果仍不十分滿意。

瘢痕的產(chǎn)生與傷口愈合過程中成纖維細(xì)胞異常增生以及傷口創(chuàng)緣兩側(cè)局部的張力有著密切的關(guān)系。為了減少傷口愈合過程中的瘢痕增生，我們需要在抑制成纖維細(xì)胞異常增生和降低傷口局部張力方面尋找好的解決辦法。BTXA可以作用于膽堿能運(yùn)動神經(jīng)末梢，通過拮抗鈣離子的作用，干擾乙酰膽堿從運(yùn)動神經(jīng)末梢的釋放，這種去神經(jīng)化作用在注射治療后可維持2～6個月[5]，從而降低肌肉收縮而產(chǎn)生的牽拉張力。近年來，關(guān)于肉毒素A對于瘢痕組織中成纖維細(xì)胞活性抑制作用的研究一直是瘢痕治療領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。

成纖維細(xì)胞作為一類重要的炎癥細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分和創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞。它在創(chuàng)面修復(fù)過程中活化、增殖并合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，其異常增殖是增生性瘢痕發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[6]。國內(nèi)外對增生性瘢痕模型的研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素局部應(yīng)用于創(chuàng)面能減少瘢痕組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，降低膠原Ⅰ/Ⅲ比值，從而能抑制增生瘢痕的形成[7]。在本研究中，我們通過對兔耳瘢痕模型治療組與瘢痕組的大體觀察，發(fā)現(xiàn)治療組瘢痕大小較非治療組增生明顯降低，兩組瘢痕增生指數(shù)存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異。成纖維細(xì)胞增殖活性結(jié)果提示：BTXA治療組瘢痕內(nèi)的成纖維細(xì)胞活性明顯較未治療組降低。提示BTXA可以抑制成纖維細(xì)胞活性，降低成纖維細(xì)胞對于膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成水平，從而減輕瘢痕的增生。另外，BTXA可能影響成纖維細(xì)胞生長周期，誘導(dǎo)其啟動正常的凋亡程序，加速成纖維細(xì)胞的自然凋亡，降低成纖維細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制瘢痕的異常增生。

TGF-β有3 種亞型，分別是 TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，其中TGF-β1所占的比例最高。TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化細(xì)胞間質(zhì)的一類多功能細(xì)胞因子，對很多纖維化疾病具有促進(jìn)作用，是目前發(fā)現(xiàn)的與瘢痕增生關(guān)系最密切的細(xì)胞因子之一[8]。TGF-β1在增生性瘢痕中含量的高表達(dá)，提示其在瘢痕形成的多個階段均有重要作用[9]。其不僅能夠促進(jìn)膠原 mRNA的轉(zhuǎn)錄，增加膠原的表達(dá)、調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡、 還可以通過抑制膠原酶等金屬蛋白酶的分泌及刺激蛋白酶抑制劑的表達(dá)，從而抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的降解[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)肉毒素治療組(T組)兔耳瘢痕成纖維細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)含量較瘢痕組(S組)明顯減少，提示BTXA可以通過降低瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)以降低膠原的表達(dá)、抑制成纖維細(xì)胞的增殖、促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制瘢痕增生的效果。

本動物實(shí)驗(yàn)證明，通過對兔耳瘢痕中成纖維細(xì)胞活性和增殖的抑制，肉毒素A可以降低成纖維細(xì)胞對于膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及下調(diào)細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)，從而起到抑制瘢痕增生的效果。