重樓皂苷I對大鼠原代成骨細胞增殖的影響及機制研究*

吳 志，龐 敏，陳 森，牛銀波，林冠杰

1.廣東省湛江市第四人民醫(yī)院(湛江524008)，2.西北工業(yè)大學生命科學院(西安710072)

主題詞 細胞增殖/病理生理學 成骨細胞 重樓皂苷I 骨保護素/代謝 @核因子-κB受體活化因子配體 大鼠

重樓又名“七葉一枝花”，為百合科植物，有消腫止痛、敗毒抗癌、鎮(zhèn)咳平喘、清熱定驚等作用,對癰腫跌打損傷、蛇蟲咬傷、肺癆久咳、淋巴結(jié)核、骨髓炎等癥有良效。目前，研究者們主要對中藥重樓的抗腫瘤作用機制進行了較為集中的研究與闡明[1-2]。由于重樓是云南白藥的主要成分之一，在消腫止痛與治療跌打損傷方面有良效；其生物活性成分主要是甾體皂苷。因此筆者推測重樓皂苷(PPI I)可促進運動系統(tǒng)損傷修復，并且具有防治骨質(zhì)疏松癥的潛能。本研究擬分離大鼠原代成骨細胞，通過觀察PPL I對其增殖作用的影響及相關(guān)機制，研究重樓皂苷防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

材料與方法

1 材料與試劑 PPL I購于成都瑞芬思生物科技有限公司，分子量為855.02，純度>98%。DMEM 培養(yǎng)液 (美國Hyclone 公司) ，胎牛血清 (美國Hyclone 公司) ，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜( DMSO) (美國Sigma 公司) ，CCK-8 Cell Counting Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)，ALP試劑盒 (南京建成生物公司) ，EdU 試劑盒 (廣州瑞博公司) ，OPG ，RANKL 與β-actin 抗體均購自美國Santa Cruz 公司。

2 大鼠原代成骨細胞培養(yǎng)[3]以乙醚麻醉法將4只2～3日齡的新生SD大鼠(購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心)處死后浸泡于75%酒精中5min，在無菌操作臺中取出其顱蓋骨，仔細刮除軟組織；將其浸泡在1∶4的胰酶/膠原酶液中40min，棄上清；使用眼科剪將骨塊剪為1mm3左右大小，接著加入I型膠原酶(0.1%，w/v)在37℃振蕩消化30min；加入與酶溶液等體積的含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止消化；吸取上清液，1000 r/ min 離心10min，去上清，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)30min后，將細胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶(差速貼壁法去除成纖維細胞)。重復此過程，將細胞懸液接種于同一培養(yǎng)瓶。待細胞貼壁并鋪滿培養(yǎng)瓶底部，用0.25 %胰蛋白酶消化，按1∶2 比例傳代。

3 細胞培養(yǎng)與藥物處理 在37℃、5% CO2的細胞孵箱中，使用加入10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠原代成骨細胞。以DMSO為溶劑將PPL I配置成為濃度為1 mol/L的儲藏液，放入4 ℃冰箱保存。使用前用培養(yǎng)液將儲藏液稀釋成工作濃度。成骨細胞隨機分為對照組及給藥處理組 (細胞增殖實驗設(shè)置3、10、30、100 μmol/L 4 個濃度; 其他實驗選擇3、10、30μmol/L 3 個濃度)。

4 細胞增殖率的檢測 選擇生長狀態(tài)良好的大鼠原代細胞，行胰酶消化后，將細胞接種于96孔板中，接種密度為2×103/孔，培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長12 h，充分貼壁后隨機分組。對照組細胞，僅加入含0.54‰ DMSO的200 μl培養(yǎng)液，給藥各組則分別加入200 μl含不同濃度(3、10、30、100 μmol/L)的PPL I的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4h，結(jié)束培養(yǎng)。使用Bio-Rad酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光值。計算細胞增殖率：細胞增殖率/% =(試驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。實驗重復3次。

5 EdU 試劑盒檢測成骨細胞的增殖 細胞接種及給藥流程同細胞增殖率檢測，待不同濃度的重樓皂苷(3、10、30 μmol/L)作用于成骨細胞48 h 后，依據(jù)EdU試劑盒說明書進行操作，使用奧林帕斯熒光顯微鏡采集圖像。

6 堿性磷酸酶( ALP) 活性測定 將大鼠原代成骨細胞(2×104/孔)接種于24孔板內(nèi)。待細胞充分貼壁(12 h)后，換用含3、10、30 μmol/L PPL I的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h。依照堿性磷酸酶試劑盒說明書進行操作。使用美國Beckman公司DU800型紫外分光光度計測定各組在520 nm處吸光度，換算為ALP活力單位，并檢測每個樣品的蛋白含量，結(jié)果用U/mg蛋白表示。

7 免疫印跡法測定OPG與RANKL的表達 待細胞培養(yǎng)2 d后，使用細胞刮刮取收集實驗各組細胞，加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制劑，碧云天公司)細胞裂解液提取總蛋白，用Bradford 法測定蛋白濃度。以30 μg/孔的量上樣，接著行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜。在室溫下采用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h后，NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗OPG (1∶200)，RANKL(1∶200)，β-actin(1∶1000) 室溫孵育30 min 后4℃ 過夜，TBST洗膜后加1∶6 000稀釋的HRP標記二抗室溫孵育1 h，TBST及TBS洗膜后，進行化學發(fā)光。

8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，選擇單因素方差分析(ANOVA)的方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 PPL I能夠促進大鼠原代成骨細胞增殖 與對照組相比，3、10、30、100 μmol/L的重樓皂苷作用于細胞24 h后均能促進成骨樣細胞增殖(P<0.01)，見 表1。 EdU結(jié)果(圖1) 再次表明PPL I能夠有效地刺激大鼠原代成骨細胞的增殖。

表1 PPL I對大鼠原代成骨細胞增殖的影響(n=3，%)

紅色信號顯示處于增殖狀態(tài)的細胞，藍色信號顯示細胞核;A:對照組; B:PPL I 3 μmol/L; C:PPL I 10 μmol/L; D:PPL I 30 μmol/L

圖1 EdU 檢測PPL I對大鼠成骨細胞增殖的影響 (×200)

2 PPL I能夠上調(diào)大鼠原代成骨細胞的ALP 活性 PPL I (3、10、30μmol/L) 作用于細胞48 h 或72 h 后，細胞的ALP 活性均顯著升高。在48 h 與72 h 時，對照組細胞的ALP 活性分別為: ( 0.21 ± 0.02)、(0.22 ± 0.02) U/mg 蛋白。而加入重樓皂苷(3、10、30 μmol/L) 48 h 后，ALP 活性分別為( 0.26 ± 0.02)、( 0.33 ± 0.04)、( 0.43 ± 0.03) U/mg 蛋白; 72 h 后，分別為( 0.31 ± 0.02)、( 0.38± 0.02)、 ( 0.49 ± 0.04) U/mg 蛋白。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。

3 PPLI對大鼠原代成骨細胞中OPG，RANKL的蛋白表達的作用 Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，PPL I (3、10、30 μmol/L) 處理大鼠原代成骨細胞48 h 后，細胞中RANKL的蛋白表達明顯降低，OPG的表達明顯升高。該作用呈現(xiàn)出濃度依賴性 (圖2) 。

圖2 PPL I對大鼠原代成骨細胞OPG與RANKL的蛋白表達水平的影響

討 論

骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個嚴重問題。在發(fā)達國家，例如美國和瑞典，老年人骨質(zhì)疏松的患病率分別為13%～18%和21.2%[5-6]。在中國，老年人骨質(zhì)疏松的平均患病率估計為15.7%，隨著總?cè)丝谀挲g的增長，骨質(zhì)疏松的患病率逐漸增加[7]。截至2013年底，中國60歲及以上老年人約為2.0243億患骨質(zhì)疏松癥[7]。

重樓為百合科植物云南重樓的干燥根莖，味苦、微寒、有小毒、歸肝經(jīng)[4]。現(xiàn)己從重樓中分離并鑒定了50多種化合物，主要有甾體皂普、植物甾醇、黃酮苷、蛻皮激素及多糖等，還含有19種氨基酸和30多種微量元素[8]。本品提取物具有止血、抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等作用。重樓在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良效，是云南白藥的主要成分之一，其主要化學成分為甾體皂苷，約占總化合物數(shù)目的80%。

本研究表明: PPL I可通過降低RANKL的蛋白表達，升高成骨細胞中OPG的表達，進而促進大鼠原代成骨細胞的增殖、并上調(diào)其成骨活性。提示PPL I具有防治骨質(zhì)疏松潛能。

成骨細胞在骨骼損傷修復以及骨質(zhì)發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用，它是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。該研究中，所用的原代成骨細胞提取自新生大鼠顱蓋骨。與細胞系相比，原代細胞無論在生物學特性方面還是在對藥物刺激的反應方面均更為接近在體模型。細胞增殖試驗結(jié)果表明: 與對照組相比，PPLI ( 3、10、30、100 μmol/L) 能夠顯著地、濃度依賴性地促進大鼠原代成骨細胞增殖。為了較為清晰地研究相關(guān)機制，后續(xù)實驗中均采用3、10、30 μmol/L這三個濃度。EdU試驗結(jié)果再次提示PPL I能夠有效地促進成骨細胞增殖。隨后，筆者選擇ALP這個指標，研究PPL I對成骨細胞成骨活性的影響，發(fā)現(xiàn)PPL I能夠明顯升高細胞中的ALP 活性。上述結(jié)果提示:在重樓促進運動系統(tǒng)損傷修復中，PPL I促進成骨樣細胞增殖可能發(fā)揮著重要作用。由于在防治骨質(zhì)疏松中，成骨細胞的增殖發(fā)揮了重要作用，故本研究采用分子生物學技術(shù)對PPLI如何促進成骨細胞細胞增殖的機制作進一步的探討。

骨保護蛋白 (OPG)/核因子-κB 受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)/核因子-κB 受體活化因子( Receptor activator of NF-κB, RANK) 軸在骨吸收和骨形成偶聯(lián)中發(fā)揮了十分重要的作用。OPG是已知唯一的與成骨細胞細胞膜上的RANKL結(jié)合的餌受體，它通過競爭性地抑制RANKL與RANK的結(jié)合，阻止由成骨細胞引發(fā)的破骨細胞前體分化、存活與融合，發(fā)揮誘導破骨細胞凋亡，抑制成熟破骨細胞活化的作用[9-11]。因此，在骨重建中，RANKL-RANK-OPG維持著骨吸收與骨形成動態(tài)平衡。本研究中，Western blot 實驗結(jié)果表明: PPL I能夠有效地上調(diào)成骨細胞中OPG的蛋白水平，并下調(diào)RANKL的蛋白水平。提示PPL I可能通過影響RANKL-RANK-OPG的活性來調(diào)節(jié)并影響成骨細胞以及破骨細胞功能平衡，并最終發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松的作用。

本研究觀察到PPL I能夠促進大鼠原代成骨細胞的增殖，并上調(diào)其成骨活性；升高成骨細胞中OPG的表達，并降低RANKL的蛋白表達。鑒于成骨細胞增殖與活化在運動系統(tǒng)損傷修復中發(fā)揮的重要作用，筆者推測重樓中的皂苷部分能通過促進成骨細胞的增殖與活化發(fā)揮修復損傷的作用。下一步，筆者計劃采用大鼠骨質(zhì)疏松模型(去卵巢和/或尾吊失重模型)，觀察重樓皂苷I的體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松活性及相關(guān)機制。