根癌農桿菌Ti質粒簡介

王裕鵬

(海南省洋浦經濟開發區洋浦中學 578000)

人教版高中生物學教材選修3中提到，將目的基因導入植物細胞的方法中采用最多的是農桿菌轉化法，其中根癌農桿菌細胞中的Ti質粒在整個轉化過程中起到了關鍵作用。本文就Ti質粒相關知識進行梳理和總結。

1 Ti質粒的分類和結構

1.1 Ti質粒的分類 農桿菌是一類能侵染植物受損傷部位，進而引起植物細胞產生冠癭堿和毛狀根的革蘭氏陰性土壤桿菌。它包括根癌農桿菌和發根農桿菌兩類。而致瘤質粒(tumor-inducing plasmid，簡稱為Ti質粒)是根癌農桿菌細胞擬核區外分離到的一種能自主復制的雙鏈環狀DNA分子，長度約為200～250Kb。Ti質粒可以誘導植物細胞產生不同種類的冠癭堿，根據產生冠癭堿的類型，Ti質粒可以分為4類： 章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型和琥珀堿型[1]。

1.2 Ti質粒的結構 從結構上看，Ti質粒包括T-DNA區、毒性區、接合轉移區和復制起始區4部分。其中，T-DNA區和毒性區參與了外源基因的轉移整合，其結構特點如下： ①T-DNA區。該區是根癌農桿菌侵染植物細胞時，Ti質粒在相關蛋白的作用下被切割下來整合至植物基因組的一段DNA分子。該區段分布一些與激素合成相關的基因，其表達產物能引起植物細胞激素紊亂，進而導致腫瘤的形成。由于Ti質粒類型不同，T-DNA長度也有所不同，總體介于12～24Kb之間。其最重要的區域是分別位于左右兩端邊界處25bp的重復序列，兩者在T-DNA轉移外源基因整合至植物基因組中發揮功能，其中右邊界序列的作用更為重要。②毒性區(Vir區)。該區是位于T-DNA以外的一段DNA分子，長度介于30～40Kb之間。不同類型的Ti質粒Vir區結構也有所不同，以胭脂堿型Ti質粒為例，其Vir區有7個操縱子，共22個基因，分別為VirA,VirB1-VirB11,VirC1,VirC2,VirD1-D4,VirE1,VirE2,VirG,Virtzs。這些基因編碼的蛋白質在T-DNA轉移整合中起輔助作用，其本身不會與植物基因組整合[2]。

2 Ti質粒的轉化機理

在過去的幾十年間，關于根癌農桿菌轉化植物細胞的分子機制得到了廣泛研究。目前，人們普遍認同Ti質粒轉化過程可分為8個相互關聯的階段[3]，分別為： ①當植物受到創傷后，會分泌酚類化合物，吸引農桿菌移向植物細胞，然后與植物細胞相關受體蛋白特異性結合；②VirA蛋白是位于細菌細胞膜上能識別植物酚類化合物的受體蛋白，兩者結合后引發VirG蛋白的磷酸化；③由于VirG蛋白磷酸化，使其從非活性狀態轉變至活性狀態，并作為激活因子結合至其他Vir基因的啟動子上，開啟Vir基因表達；④VirD1和VirD2蛋白作用于T-DNA的底鏈上，將其切割形成單鏈T-DNA分子(即T-strand)；同時VirD2蛋白以共價方式連接在T-strand的5′端，形成一個不成熟T鏈復合物；⑤VirD4和VirB類蛋白結合形成具有轉運功能的通道，協助不成熟T鏈復合物和一些Vir蛋白進入植物細胞中；⑥在轉運途中，VirE2蛋白包被在不成熟T鏈復合物上，構成成熟T鏈復合物；⑦成熟T鏈復合物和一些植物細胞蛋白(Ran、 VIP1等)進一步識別結合，協助T鏈復合物經核孔到達細胞核；⑧在VirD2、 VirE2和植物細胞相關蛋白的協助下，T-strand與植物細胞基因組完成整合。

3 Ti質粒在實際應用中的改造

高中生物學教材提到用于基因工程的載體分子量并不大： 如TA克隆用到的pMD19質粒長度僅有2692bp，原核表達蛋白質常用質粒pET-28a長度也只有5369bp。而Ti質粒長度約200Kb左右，片段過大，不易操作。所以野生型Ti質粒需改造才能應用于植物基因工程。

關于Ti質粒的改造方法中最常見的是雙元載體系統[1]。前面提到Vir區對T-DNA的轉移至關重要，但它并沒有和T-DNA區連在一起。基于此，可以把這兩個區段分別改造到兩個質粒上。通常是將含T-DNA的質粒稱之為微型Ti質粒，它缺失Vir基因，但含有復制起點、標記基因和多克隆位點，能整合外源基因。由于該質粒在大腸桿菌和農桿菌中均可以復制保存，也稱之為大腸桿菌-農桿菌穿梭質粒。將含一整套Vir區基因但缺失T-DNA區的質粒稱之為輔助Ti質粒。兩種質粒構建完成后，采用一定的方法將它們轉入同一株農桿菌中，構成雙元載體系統，就能使T-DNA整合至植物基因組中。此外，人們還建立了共整合載體、超級雙元載體等系統。

4 Ti質粒在基因工程中的適用范圍

早期研究發現，農桿菌轉化法主要適用于雙子葉植物和裸子植物。因為像玉米、水稻和小麥等多種單子葉植物對農桿菌的感染持抗拒態度。但是隨著分子生物學的迅速發展，該項技術得到了優化，使其逐步成為轉化單子葉植物的常規手段。其優化策略主要包括以下幾個方面： ①添加表面活性劑增強農桿菌和植物細胞間的吸附能力；②人為提高酚類化合物的含量，更加高效地激活Vir基因表達；③采用超聲波處理植物，使植物組織形成微傷口，增加農桿菌的感染幾率；④添加抗氧化劑去除植物細胞由于農桿菌感染形成的過氧化物，減少植物組織培養中愈傷組織的褐化，提高轉化效率[4]。

目前，農桿菌轉化法的適用范圍已超出了植物界，并延伸至芽殖酵母、裂殖酵母和多種絲狀真菌等生物中。由于簡單有效，該基因傳遞系統同樣成為了真菌遺傳改良中極為有效的工具之一[5]。更為重要的是，有人發現根癌農桿菌可以轉化實驗室中培養的HeLa細胞，這為研究該方法能否適用于人類細胞奠定了基礎[6]。