基于高效液相指紋圖譜檢測(cè)參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量測(cè)定

王雪梅 李艷嬌 宋燕青

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)春,130000)

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,是以四君子湯為基礎(chǔ)的,處方由人參、茯苓、白術(shù)、山藥、甘草、白扁豆、蓮子等十味藥組成,所有藥物均以全原粉入藥,主要起補(bǔ)脾胃、益肺氣的功用[1-3]。目前2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)中有收載參苓白術(shù)散這一以人參為君藥的藥方,但目前參苓白術(shù)散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未收載人參或人參皂苷含量測(cè)定項(xiàng)[4],而市面上參苓白術(shù)散的廠家較多,且原藥材人參的質(zhì)量差異也很大。因此人參皂苷作為人參中的重要成分,通過(guò)測(cè)定參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量,可以作為控制參苓白術(shù)散質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。目前常用的人參皂苷含量測(cè)定方法有可見(jiàn)-紫外分光光度法[5-6]、薄層掃描法(TLCS)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8],其中HPLC的具有高效性、高靈敏度、較廣的應(yīng)用范圍而為越來(lái)越多中藥研究人員使用和認(rèn)可,因此本研究以不同廠家不同批次的15批參苓白術(shù)散進(jìn)行檢測(cè),建立參苓白術(shù)散中3種人參皂苷Rg1、Re及Rb1含量測(cè)定的方法。現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilengt-1100高效液相色譜儀(Agilengt公司購(gòu)買),ThermoODS-HYPERSIL色譜柱(廣州太瑋生物科技有限公司購(gòu)買),FR10小型超聲波清洗器(功率250 W,頻率50 Hz;杭州法蘭特超聲波科技有限公司)。

1.2 試劑 中國(guó)食品藥品檢定研究院人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):110703-201027)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào):110754-200822)和人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):110704-20092),色譜純和分析純均購(gòu)買于天津賽孚瑞科技有限公司。

1.3 分析樣品 參苓白術(shù)散(哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠,國(guó)藥準(zhǔn)字Z23022087),分別取15個(gè)不同批次,依次編號(hào)為001、002、003、004、005……015。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 進(jìn)樣量為10 μL,采用250 mm×4.6 mm,5 μm的色譜柱(ThermoODS-HYPERSIL柱),選擇流動(dòng)相的條件是在A流動(dòng)相乙腈和B流動(dòng)相水中以1 mL/min的流速開(kāi)展實(shí)驗(yàn),檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm,柱溫為30 ℃,根據(jù)高效液相(HPLC)(Agilengt-1100高效液相色譜儀)指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn),并在Agilengt-1100色譜工作站上進(jìn)行指紋圖譜分析。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):110703-201027)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào):110754-200822)和人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):110704-20092)置于容量瓶中,甲醇溶解,制成混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取5個(gè)不同生產(chǎn)批次分別編號(hào)為001、002、003……015的參苓白術(shù)散的內(nèi)容物,精密取5 g粉末,采用四號(hào)篩過(guò)濾于濾紙筒中,整筒藥品經(jīng)過(guò)含有三氯甲烷提取器加熱回流3 h,棄去廢液,含有藥渣濾紙筒移入100 mL錐形瓶中,精密加入50 mL水飽和正丁醇,密塞放置12 h以上,后采用FR10小型超聲波清洗器(功率250 W,頻率50 Hz;杭州法蘭特超聲波科技有限公司)進(jìn)行超聲處理30 min,濾過(guò),棄初濾液僅取續(xù)濾液25 mL,蒸干取殘?jiān)⒓蛹状既芙狻⒍ㄈ莶u勻,用0.45 μm濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。陰性樣品溶液則取不含人參的參苓白術(shù)散同上述方法進(jìn)行制備。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè),記錄色譜圖并對(duì)專屬性進(jìn)行比較,結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re及Rb1均有良好的專屬性。

2.5 線性關(guān)系考察 根據(jù)2.2制備的人參皂苷對(duì)照品溶液,分別精密取加入甲醇制備0 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL等,分別編號(hào)1～4并連續(xù)進(jìn)樣,以峰面積為Y軸,5 μL進(jìn)樣濃度為X軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)人參皂苷對(duì)照品的回歸方程計(jì)算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。提示人參皂苷的線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。

表1 人參皂苷的回歸方程

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取上述人混合參皂苷對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,在上述2.1色譜條件下,記錄峰面積,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD在0.22%～0.29%,結(jié)果表明HPLC儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一參苓白術(shù)散供試品溶液,在上述2.1色譜條件下,分別于0、4、11、20、30 h等不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD在0.06%～1.83%；表明參苓白術(shù)散供試品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密取6份參苓白術(shù)散供試品溶液,按上述2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總量的含量平均值為9.86 mg,RSD2.5%,表明參苓白術(shù)散供試品溶液的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱定,置具塞錐形瓶中,一式6份,以3份為一組,分別精密加入混合對(duì)照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,精密加入70%甲醇溶液20 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,分別用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,測(cè)定加樣回收率,如表2～4結(jié)果顯示人參皂苷的加樣回收率良好。

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率

表3 人參皂苷Re加樣回收率

表4 人參皂苷Rb1加樣回收率

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 參苓白術(shù)散HPLC指紋圖譜分析 根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)提出的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A進(jìn)行相似度分析,采用MATLAB軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)。由圖1、圖2得,通過(guò)HPLC指紋圖譜分析,人參皂苷混合對(duì)照品分別于參苓白術(shù)散供試品溶液的色譜峰保留時(shí)間一致,且陰性對(duì)照溶液未對(duì)其造成干擾影響。

圖1 參苓白術(shù)散高效液相指紋圖譜

注：A.人參皂苷混合對(duì)照品溶液,B.參苓白術(shù)散供試品溶液,C陰性供試品溶液

2.10.2 人參皂苷含量測(cè)定 不同批次參苓白術(shù)散中人參皂苷總的含量存在較大差別。見(jiàn)表5。

表5 參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量測(cè)定

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 在參苓白術(shù)散定量檢測(cè)工作中,人參的是參苓白術(shù)散中的君藥,其主要檢測(cè)成分是人參皂苷,目前檢測(cè)人參皂苷的鑒別或定量分析方法都比較成熟[9-11],而人參皂苷中常用檢測(cè)的是Rg1、Re、Rb1等3種亞型，其中可見(jiàn)-紫外分光分光度法只能檢測(cè)總皂苷而對(duì)亞型的敏感性較低故予以排除,而在薄層掃描法(TLCS)操作環(huán)節(jié)繁瑣,且由于TLCS相對(duì)較容易受外界條件影響;其中HPLC因其操作過(guò)程較為簡(jiǎn)便,且整個(gè)分離過(guò)程系統(tǒng)較為封閉,突出HPLC的高效性、高靈敏度和較廣的應(yīng)用范圍,因此選用HPLC指紋圖譜作為本研究的主要方法[12-14]。本研究流動(dòng)相的選擇中Rg1和Rb1檢測(cè)方法,在C18柱中,試驗(yàn)探索性研究曾比較甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相的差異,Re和Rg1在流動(dòng)相60%甲醇或者15%乙腈均能夠洗脫,且分離度較好;而Rb1的流動(dòng)相在80%甲醇或者40%乙腈的情況下也能夠洗脫出比例超過(guò)1∶1分離度,但從總的結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn),當(dāng)流動(dòng)相是乙腈-水的時(shí)候,Rg1無(wú)論從峰形的分離度、干擾度和總共所用的分析時(shí)間來(lái)說(shuō)結(jié)果最好,能夠分離出最低基線噪聲且峰形最好。

3.2 HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義 線性回歸方程在某一個(gè)濃度或峰高(面積)情況下進(jìn)行樣品分析是否是準(zhǔn)確的,換句話說(shuō),在這個(gè)成線性范圍內(nèi),待測(cè)參苓白術(shù)散樣品溶液面積要與濃度成正比,因?yàn)樵谶@個(gè)范圍內(nèi)濃度與面積成正比,分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的且符合紫外檢測(cè)器的朗伯比爾定律[12-14]。而加樣回收率試驗(yàn)的研究一般包括絕對(duì)回收率試驗(yàn)和相對(duì)回收率試驗(yàn),本研究參苓白術(shù)散所涉及的是相對(duì)回收率試驗(yàn);有研究人員表示相對(duì)回收率主要一種是回收試驗(yàn)法,而另外一種是加樣回收試驗(yàn)法[17-18]。因?yàn)榧訕踊厥赵囼?yàn)法,就是在已知濃度樣品中加入藥物,來(lái)和標(biāo)準(zhǔn)曲線比,標(biāo)準(zhǔn)曲線也是在基質(zhì)中加藥物,因此本研究HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性的考察選用加樣回收試驗(yàn)法。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行紫外光譜掃描,發(fā)現(xiàn)在不同波長(zhǎng)的檢測(cè)下,參苓白術(shù)散樣品色譜圖在203 nm處有最大吸收,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1色譜峰的紫外光譜掃描結(jié)果與對(duì)照品一致,故本研究確定檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

3.4 含量測(cè)定提取方法的選擇 經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)[11,19-22]已選擇高效液相色譜法對(duì)參苓白術(shù)散人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定,目前的研究對(duì)參苓白術(shù)丸中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量報(bào)道仍較少。本研究試圖通過(guò)對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的HPLC指紋圖譜分析以及對(duì)總的人參皂苷的總含量測(cè)定對(duì)參苓白術(shù)散的質(zhì)量做一個(gè)分析研究。在HPLC指紋圖譜試驗(yàn)中采取回流提取、超聲提取等多種方法,結(jié)果顯示超聲處理提取效率最高,故本研究采用超聲處理的提取方式對(duì)參苓白術(shù)散中的人參皂苷進(jìn)行提取。同時(shí)在提取溶劑的選擇中,對(duì)50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇等4種不同濃度的提取溶劑進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇的提取效率最低,而甲醇提取溶劑僅當(dāng)其濃度為70%進(jìn)行提取時(shí),研究可獲得最高人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的提取效率,故本研究選擇用70%甲醇作為提取溶劑。