活血化瘀法與氨基葡萄糖膠囊治療創傷性膝骨性關節炎基質金屬蛋白酶表達的影響

陳明光 陳仕強 楊 寧 楊 進 李引剛 曹曉霞 常春峰 吳雪蘭

(1 陜西中醫藥大學附屬醫院骨創傷一科,咸陽,712000; 2 陜西中醫藥大學,咸陽,712000; 3 陜西中醫藥大學附屬醫院第二手術麻醉科,咸陽,712000)

骨性關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種能夠影響關節軟骨、軟骨下骨、滑膜、半月板和韌帶的復雜的退行性疾病[1]。OA是一種進行性疾病,當病情的發展最終導致顯著性殘疾時,通常需要昂貴的關節成形術,目前OA的臨床治療受到限制,暫無治愈OA的藥物。創傷性骨關節炎(Post-traumatic Osteoarthritis,PTOA),是OA潛在亞型中的一種,占OA總數的12%以上,最常見于踝關節和膝關節損傷,特別是關節內骨折,引發的一種進行性關節退變疾病[2-4]。其中由膝關節損傷導致關節軟骨發生退行性病變的繼發性OA稱為創傷性膝骨性關節炎(Post-traumatic Knee Osteoarthritis),是老年致殘的五大主要成因之一[5]。文獻報道,在OA關節軟骨中基質的合成代謝、基質組分修復和分解代謝紊亂之間存在不平衡,因此通常認為疾病的發生歸因于關節組織的損壞[6]。軟骨細胞通過停止產生合成代謝因子和釋放更多的分解代謝酶如基質金屬蛋白酶(MMPs)來應答關節組織的損壞[7]。有證據表明,軟骨細胞表達的基質降解酶和它們的抑制劑MMP3的比例異常增加可破壞細胞外基質,引發關節損傷[8]。創傷后膝骨關節炎患者的臨床表現,診斷方法和治療方面的考慮與原發性骨關節炎患者的類似,兩者主要區別是在初始診斷時二者的年齡差異,創傷性膝骨關節炎患者初始診斷年齡一般較原發性骨關節炎患者早。并且兩者目前均無可治愈性藥物,具體發病機制也尚不清楚。目前主要采用口服鹽酸氨基葡萄糖、活血化瘀類中藥方來緩解此類疾病的臨床癥狀,而創傷性膝骨性關節炎的發病機制的探討較少。本文將分別采用口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊和口服活血化瘀中藥湯劑來治療創傷性膝骨性關節炎,并探討其相關發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年12月陜西中醫藥大學附屬醫院收治的創傷性膝骨性關節炎患者60例,其中男33例,女27例,平均年齡(48.5±11.7)歲;將擬納入的60例病例按就診順序編號從1～60號,在電子計算機上應用Excel產生隨機數,并按1∶1比例隨機分為觀察組和對照組,每組30例。隨機化研究有其特殊的醫患問題,必須認真仔細對待。該研究特別強調隨機分配的是患者而不是膝關節。如果一個患者被診斷為兩側膝關節炎,則被分配到一組。觀察組和對照組在治療前、治療6個療程后進行關節液與血液抽取。關節液的抽取:從髕骨上方、股四頭肌腱外側將注射器向內下刺人關節囊。進入關節腔后,抽出關節液1～3 mL,立即置無菌離心管中,在4 ℃條件下2 000 r/min離心10 min,取上清液置于-80 ℃冰箱(山東博科科學儀器有限公司,BDF-86H50)保存備用。血清的制取:患者在安靜狀態下空腹采血5 mL,4 ℃條件下離心后抽取上層血清取上清液置于-80 ℃冰箱(山東博科科學儀器有限公司,BDF-86H50)保存備用。蛋白芯片相關檢測產品與分析服務由上海英拜生物科技有限公司提供。產品人金屬基質酶定量抗體芯片Human MMP Array:MMP-1,MMP-3，MMP-13均購于上海英拜生物科技有限公司。

1.2 診斷標準 參考美國風濕協會1995年診斷標準。

1.3 納入標準 所有患者均有膝關節外傷史或者慢性勞損病史,且臨床表現出膝關節疼痛及功能活動障礙,均符合中華醫學會風濕病學分會提出的膝關節骨性關節炎診斷標準。

1.4 排除標準 排除標準參考蘇雅紅等病理排除標準[9]。

1.5 治療方法 對照組患者在飯時或飯后口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊(由浙江誠意藥業股份有限公司，國藥準字H20060748),1粒/次,2次/d。觀察組給予口服活血化瘀止痛中藥復方湯劑處理,中藥湯劑選用自擬方:當歸15 g、川芎12 g、白芍12 g、桂枝9 g、牛膝12 g、雞血藤15 g、土鱉蟲10 g、血竭5 g、麻黃6 g、生甘草15 g),制劑由陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心提供。服藥方法參考蘇雅紅等湯劑煎服劑量[9],1劑/d,水煎服,2次/d。觀察組與對照組連續用藥4周為1個療程,觀察時間為6個療程,觀察期間不得使用其他具有止痛作用的中藥和西藥,不進行任何理療、針灸及外用藥物治療。

1.6 觀察指標 觀察膝關節癥狀分級量化評分,膝關節疼痛指數,中醫癥候積分,首次用藥疼痛起效時間,舌、脈象變化等。

1.7 療效判定標準

1.7.1 療效評價指標及臨床評價時點 1)膝關節癥狀分級量化評分,具體評分標準參考邱建文等[10],治療前、治療1周、12周、24周各記錄1次;2)膝關節疼痛指數,通過患者記錄卡每周記錄;3)中醫癥候積分,治療前、治療12周、治療后各記錄1次;4)首次用藥疼痛起效時間,由患者記錄首次服藥后,自覺疼痛開始緩解的時間(以天為單位計);5)舌、脈象變化:治療前、治療12周、治療后各記錄1次。

1.7.2 膝骨性關節炎恢復情況判定標準 1)臨床控制:膝關節癥狀量化積分減少≥95%;2)顯效:膝關節癥狀量化積分減少≥70%,<95%;3)有效:膝關節癥狀量化積分減少≥30%,<70%;4)無效:膝關節癥狀量化積分<30%。

1.7.3 中醫癥候恢復情況評價 1)臨床控制:中醫癥候積分減少≥95%;2)顯效:中醫癥候積分減少≥70%,<95%;3)有效:中醫癥候積分減少≥30%,<70%;4)無效:中醫癥候積分<30%。

2 結果

2.1 治療后2組創傷性膝骨性關節炎恢復情況 結果顯示觀察組和對照組在治療6個療程后,觀察組的控顯率和總有效率明顯高于對照組,其中觀察組和對照組的控顯率分別為63.3%和36.7%,總有效率分別為93.3%和73.3%,差異均有統計學意義(P<0.05)。即2種治療方法均能對創傷性膝骨性關節炎起到一定程度的恢復效果,而口服活血化瘀中藥湯劑對創傷性膝骨性關節炎恢復情況比口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊效果要顯著。見表1。

2.2 2組治療前后膝關節炎性反應狀分級量化積分和膝關節疼痛指數的記錄 2組在治療1周、12周和24周后的積分和疼痛指數均較治療前均顯著降低(對照組:P<0.05,P<0.01,P<0.01;觀察組:P<0.01,P<0.01,P<0.01),且觀察組在6個療程的治療過程中積分和疼痛指數均顯著低于對照組,2組之間差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、表3。

表1 2組治療前后創傷性膝骨性關節炎的恢復情況比較

注:與對照組比較,*P<0.05

表2 2組治療前后膝關節炎性反應狀分級量化積分比較分)

注:與治療前比較,*P<0.05,**P<0.01;與對照組比較，△P<0.05

表3 2組治療前后膝關節疼痛指數比較

注:與治療前比較,*P<0.05,**P<0.01;與對照組比較，△P<0.05

表4 2組治療前后中醫癥候情況比較

注:與對照組比較,*P<0.05

2.3 2組治療前后中醫癥候的恢復情況比較 觀察組和對照組在治療后,觀察組控顯率和總有效率均明顯高于對照組,其中觀察組的控顯率和總有效率分別為66.7%和9%,而對照組的分別為40.0%和76.7%,對照組和觀察組兩者之間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.4 2組治療前后中醫癥候積分的比較 比較2組治療前,在治療后第12周和治療后的中醫癥候積分均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),并且治療后2組之間進行比較,差異有統計學意義(P<0.05)。結果顯示,2種治療方法均能明顯降低中醫癥候積分,且觀察組的治療效果明顯優于對照組。見表5。

2.5 2組治療前后關節液和血清中MMP13水平的檢測結果比較 蛋白芯片檢測儀檢測出的熒光強度的強弱代表蛋白的表達水平的高低。結果顯示在關節液中,對照組治療前后MMP13的熒光強度分別為(5 162.6±279.4)和(5 241.4±223.0);而在血清中治療前后的熒光強度分別為(3 414.6±189.4)和(3 451.3±263.3);觀察組治療前后關節液中MMP13的熒光強度分別為(4 988.8±218.7)和(5 125.8±348.4);而血清中治療前后的熒光強度分別為(3518.8±248.5)和(3 625.7±368.2);對照組和觀察組在治療前后關節液和血清中的MMP13的熒光強度均差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

2.3 2組治療前后關節液和血清中MMP3水平的檢測結果比較 對照組和觀察組治療前關節液中MMP3的熒光強度分別為(4 623.6±215.2)和(4 678.3±198.5),而治療后均明顯呈現出熒光強度的降低,分別為(2 288.6±293.7)和(2 321.3±198.4),2種療法治療前后熒光強度統計分析差異有統計學意義(P值均<0.001);而在血清中對照組和觀察組治療前后MMP3的熒光強度也均呈現明顯下降,對照組和觀察組治療前MMP3的熒光強度分別為(3 393.6±202.6)和(2 394.3±243.8),治療后熒光強度分別為(3 425.3±193.1)和(2 421.3±294.7),治療前后的熒光強度值進行比較分析,差異有統計學意義(P<0.001)。見表7。

2.4 2組治療前后關節液和血清中MMP1水平的檢測結果比較 結果顯示對照組在治療前后關節液和血清中MMP1的熒光強度均無明顯改變,對照組治療前關節液和血清中MMP1的熒光強度分別為(3 913.7±295.8)和(2 917.9±250.0),治療后MMP1的熒光強度分別為(3 788.6±372.1)和(2 882.1±282.3),P>0.05;觀察組在治療前關節液和血清中MMP1的熒光強度分別為(3 898.1±342.6)和(3 037.8±289.2),治療后關節液和血清中MMP1熒光強度均明顯降低,分別為(3 521.3±436.2),(P<0.001)和(2 721.4±378.4),(P<0.001)。見表8。

表5 2組治療前后中醫癥候積分比較分)

注:與治療前比較,**P<0.01;與對照組比較,△P<0.05

表6 2組治療前后關節液和血清中MMP13水平檢測結果

表7 2組治療前后關節液和血清中MMP3水平檢測結果

注:與治療前比較,***P<0.001

表8 2組治療前后關節液和血清中MMP1水平檢測結果

注:與治療前比較,***P<0.001

3 討論

目前創傷性膝骨性關節炎的病因尚不明確,臨床研究發現多數創傷性膝關節炎患者在膝關節處曾發生過單一的創傷性損傷,創傷性關節損傷引起炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶蛋白酶和其他降解酶的激增,這些降解酶中尤其是MMP有助于軟骨和軟骨下骨的退化[11]。在關節軟骨和骨骼中存在的MMP能夠在中性pH的條件下降解蛋白聚糖,蛋白聚糖在軟骨受損的修復過程中扮演著重要角色,一旦合成失衡,就會加劇軟骨退化。之前研究發現從人類關節軟骨中分離得到的MMP3能夠裂解聚蛋白聚糖IGD結構域中Asn341和Phe342之間的化學鍵,其他MMP家族成員如MMP1和MMP13之后也被發現能夠裂解相同位點以及該分子的C末端的其他位點[11]。MMP3是OA軟骨中的表達量最高的基質金屬蛋白酶,以參與激活MMP1和MMP13的酶活性而為人所熟知,并且可能通過激活隱藏的膠原酶活性導致骨性關節炎的發生[12]。

有文獻報道在膝關節置換手術期間獲得的人骨關節炎外植體中,給予5 mL的鹽酸氨基葡萄糖處理,可以顯著性降低外植體中總的基質金屬蛋白酶活性,同時能夠顯著性降低MMP3的基因表達水平,但是對MMP1、MMP13的基因表達水平無明顯影響[13],此結果也與本研究結果中對照組鹽酸氨基葡萄糖的治療效果基本一致。本研究同樣發現創傷性膝骨性關節炎患者在經鹽酸氨基葡萄糖治療后,關節液和血清中只有MMP3的熒光強度明顯降低,MMP1和MMP13均無明顯變化。王平等[14]研究發現活血化瘀膏能夠有效的緩解早中期膝骨性關節患者的臨床表征,但是對關節液中MMP13的表達無明顯效果,本研究也發現了口服活血化瘀協定方湯劑治療后能夠明顯降低患者的膝骨關節炎性反應狀分級量化積分、膝關節疼痛指數、中醫癥候積分,并且顯著性的修復創傷性膝骨性關節炎,其總有效率比較于鹽酸氨基葡萄糖組明顯增加,高達93.3%;在創傷性膝骨性關節炎的中醫證候的恢復情況統計中也發現觀察組的總有效率比較于對照組顯著增加,高達96.7%。并且發現活血化瘀法治療后患者關節液和血清中MMP13的熒光強度也基本保持不變,表明活血化瘀法治療對MMP13的表達無明顯作用。但是在本次研究中發現活血化瘀法治療后能顯著性下調患者血清和關節液中MMP1和MMP3的熒光強度,這也許能說明為何活血化瘀法臨床治療的總有效率明顯高于鹽酸氨基葡萄糖組。與本文研究類似的是,在兔膝骨關節炎軟骨模型中發現,兔關節的滑膜和軟骨中MMP1、MMP3的表達量顯著升高,而活血化瘀膏加失笑散治療后能顯著降低滑膜和軟骨中MMP1和MMP3的表達水平[15]。由此,可說明活血化瘀法中的中藥成分可能是通過抑制MMP1和MMP3的表達,緩解創傷性膝骨關節炎中MMPs對軟骨的損傷作用的。有文獻報道活血化瘀法能夠有效的抑制炎性細胞因子比如IL-1β和TNF-α的表達,而這2種因子同樣可以調控多數MMPs的基因的轉錄水平,或許能夠解釋本研究中活血化瘀法對MMP1和MMP3的抑制作用,即它可能是通過抑制炎性細胞因子的表達,轉而在基因水平下調這2種酶的表達,導致這2種酶蛋白含量降低。

本研究分別使用了2種方法來治療創傷性膝骨關節炎,結果發現口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊和口服活血化瘀協定方湯劑均能有效的緩解患者的臨床癥狀,并且這種治療效果可能是歸因于藥物對關節液和血清中MMP的抑制效果。活血化瘀中藥法總有效率高于鹽酸氨基葡萄糖膠囊,可能是由于活血化瘀中藥湯劑中復雜的中草藥成分能夠有效的抑制MMP1和MMP3的蛋白表達量,而鹽酸氨基葡萄糖膠囊只能單一的抑制MMP3的蛋白表達量,從而有效的降低對軟骨的破壞作用,緩解疾病的進程。