人血清哇巴因UPLC-MS/MS 檢測方法的建立和方法比對

趙銀霞，歐美賢，曲 毅，陸優(yōu)麗，張美微，李水軍

（1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200031；2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院老年科，上海 200031）

1961年，de Wandener等發(fā)現(xiàn)擴(kuò)容引起尿鈉排泄增加，提出這種利鈉作用可能由一種未知的體液物質(zhì)調(diào)節(jié)，這是內(nèi)源性哇巴因首先以一種利鈉因子的概念被提出。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)哇巴因是由下丘腦和垂體分泌的腎上腺皮質(zhì)激素，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[1]。哇巴因主要作用于Na+泵，與原發(fā)性高血壓和心臟肥大有關(guān)[2-3]。與健康受試者相比，高血壓患者[4-5]和心力衰竭患者[6-7]血漿哇巴因水平明顯升高。最近又有研究結(jié)果顯示，尿毒癥患者和妊娠期高血壓患者血清哇巴因水平也明顯升高[8-9]。這些研究結(jié)果均是基于免疫學(xué)測定方法得出的。哇巴因的免疫檢測方法存在特異性和穩(wěn)定性差等問題，檢測結(jié)果往往無法重現(xiàn)[10-11]。超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）利用化合物的母離子和特征碎片的質(zhì)荷比進(jìn)行檢測，具有特異性強(qiáng)、交叉干擾小、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，尤其適用于內(nèi)源性小分子標(biāo)志物的檢測。本研究擬建立檢測血清哇巴因的UPLC-MS/MS方法，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行比對，探討兩者的相關(guān)性和可比性，以期為后續(xù)哇巴因的研究提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2013年6—12月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院高血壓患者40例，其中男21例、女19例，年齡（81.7±3.0）歲，血壓＞18.62/11.97 kPa（140/90 mmHg）。另選取同期上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院體檢中心體檢健康者20名，其中男9名、女11名，年齡（34.3±3.8）歲。本研究所用血清樣本均為上述研究對象進(jìn)行常規(guī)檢測后的剩余血清。本研究獲得了上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

5500QTRAP串聯(lián)四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀及Analyt1.5.1數(shù)據(jù)采集與處理軟件購自美國Applied Biosystem公司，LC-30超高效液相色譜儀購自日本島津公司。Phenomenex kinetex色譜分析柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）及C18保護(hù)柱（4.0 mm×3.0 mm，5 μm）購自美國Phenomenex公司。哇巴因（C29H44O12·8H2O，純度為99%）購自美國Sigma公司，哇巴因-d3（批號為8-QFY-118-1，純度為97%）購自加拿大TRC公司。哇巴因ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩生物有限公司。固相萃取柱（Evolute ABN 25 mg 1 mL Array wells）購自英國Biotage公司。

1.3 UPLC-MS/MS

1.3.1 檢測條件 采用Phenomenex Kinetex色譜分析柱（100.0 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為超純水和乙腈，15%乙腈等度洗脫，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。質(zhì)譜條件為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析，母離子選擇[M-H]-峰，哇巴因及其內(nèi)標(biāo)的離子對分別為m/z 583.3→419.1及m/z 586.3→422.1。質(zhì)譜參數(shù)：霧化器（GS1）壓力為60 psi，輔助器（GS2）壓力為75 psi，氣簾氣為10 psi，碰撞氣為12 psi，電壓為-4 500 V，溫度為550 ℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控品的制備 將儲備液用生理鹽水逐級稀釋為5.0、2.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。另取1瓶儲備液用生理鹽水逐級稀釋為4.0、0.6、0.06 ng/mL的質(zhì)控品。

1.3.3 樣本前處理 在2 mL離心管中分別加入300 μL不同水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液、質(zhì)控品工作液或血清樣本，加入10 μL內(nèi)標(biāo)（120 ng/mL哇巴因-d3），再加入900 μL超純水進(jìn)行稀釋，混旋30 s后待上樣。固相萃取柱需先用1 mL甲醇活化及1 mL水平衡后才能上樣。取1 mL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本或血清樣本上樣后用1 mL水清洗，然后再用1 mL甲醇進(jìn)行洗脫。洗脫液于60 ℃用氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL 20%甲醇水溶液重組，震蕩5 min，25 150×g離心5 min后取上清液，采用UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證 采用柱后推注法（色譜柱后連接針泵）觀察蛋白直接沉淀、液液萃取、固相支撐液液萃取（solid phase supported liquidliquid extraction，SLE）、ABN固相萃取小柱萃取4種前處理方法的基質(zhì)效應(yīng)。通過比較直接提取后與空白提取后加入的分析物的峰面積比值觀察回收率。對低值（0.06 ng/mL）、中值（0.6 ng/mL）、高值（4 ng/mL）質(zhì)控品分別檢測3次，連續(xù)檢測3批，觀察準(zhǔn)確度和批內(nèi)、批間精密度[變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）]。取6份新鮮血清樣本，3份添加0.1 ng/mL哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品，另3份添加2 ng/mL哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品，觀察樣本室溫過夜放置16 h及樣本前處理后室溫放置自動(dòng)進(jìn)樣器48 h的穩(wěn)定性。最低定量檢測限（lower limit of quantification，LLOQ）為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，滿足2個(gè)條件：（1）信噪比 ≥10；（2）批內(nèi)和批間精密度均≤±20%。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍應(yīng)盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，包括正常值、異常值及醫(yī)學(xué)決定水平，并且至少包含6個(gè)非零濃度點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過最小二乘法原理，經(jīng)線性回歸后得到，權(quán)重因子為1/X，線性方程為Y=aX+b，r＞0.99。標(biāo)準(zhǔn)品可接受標(biāo)準(zhǔn)為濃度偏差≤±15%，LLOQ≤±20%。所有方法學(xué)驗(yàn)證和樣本測定批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線均滿足以上要求。

1.3.5 樣本檢測

采用UPLC-MS/MS檢測20名正常對照者、40例高血壓患者的血清樣本。另隨機(jī)收集10例患者當(dāng)天采集的新鮮血清和血漿樣本，并立即采用UPLC-MS/MS檢測。

采用ELISA檢測UPLC-MS/MS檢測過的12名正常對照者、12例高血壓患者的血清樣本。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（A）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本哇巴因的水平，ELISA試劑盒檢測范圍為0.005～0.06 ng/mL。所有樣本均稀釋5倍并采用復(fù)孔檢測。

在新鮮血清樣本中添加終濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 ng/mL的哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)采用UPLC-MS/MS和ELISA檢測。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 基質(zhì)效應(yīng)及回收率 蛋白直接沉淀、液液萃取、SLE、ABN固相萃取小柱萃取4種前處理方法的回收率分別為45%、70%、60%、85%。

2.1.2 準(zhǔn)確度和批內(nèi)、批間精密度 LLOQ和低值（0.06 ng/mL）、中值（0.6 ng/mL）、高值（4 ng/mL）質(zhì)控品的準(zhǔn)確度分別為108.0%、89.2%、101.0%、103.0%。3個(gè)水平質(zhì)控品的批內(nèi)CV分別為2.87%、1.95%、0.56%，批間CV分別為5.98%、1.90%、0.75%。

2.1.3 穩(wěn)定性 樣本室溫過夜放置16 h及樣本前處理后室溫放置自動(dòng)進(jìn)樣器48 h的檢測結(jié)果與0 h檢測結(jié)果的偏差均＜15%，結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及LLOQ 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.02～5.0 ng/mL，LLOQ為0.02 ng/mL。

2.2 樣本檢測

采用UPLC-MS/MS檢測20名正常對照者、40例高血壓患者的血清樣本及10例患者當(dāng)天的新鮮血清和血漿樣本，均未檢測到哇巴因水平高于LLOQ（0.02 ng/mL）。UPLCMS/MS檢測樣本中哇巴因的色譜圖見圖1。

ELISA檢測12名正常對照者血清哇巴因水平為0.062 ng/mL，12例高血壓患者血清哇巴因水平為0.096 ng/mL。

在新鮮血清樣本中添加終濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 ng/mL的哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品，采用2種方法同時(shí)檢測。UPLC-MS/MS檢測結(jié)果與對應(yīng)的哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品水平呈正相關(guān)，且線性較好（r2＞0.99），準(zhǔn)確度較高。ELISA檢測5個(gè)水平的哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品，測定結(jié)果均很接近（0.024 9～0.029 6 ng/mL），無明顯差異。見圖2。

圖1 哇巴因色譜圖

圖2 血清樣本添加哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品后結(jié)果

3 討論

目前，關(guān)于利用液相色譜質(zhì)譜法檢測哇巴因的文獻(xiàn)極少，多為定性或半定量研究，其中一些研究檢測的是PC12細(xì)胞中的哇巴因[12-14]。本研究建立了檢測人血清哇巴因的UPLC-MS/MS方法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。ABN固相萃取小柱處理后的基質(zhì)效應(yīng)較小，且回收率較高。本方法的線性范圍為0.02～5.0 ng/mL，準(zhǔn)確度和精密度均較好。穩(wěn)定性結(jié)果表明樣本室溫過夜放置16 h及樣本前處理后室溫放置自動(dòng)進(jìn)樣器中48 h均穩(wěn)定。采用本方法檢測正常對照者和高血壓患者的血清哇巴因水平，結(jié)果顯示二者的血清哇巴因水平均低于本方法的LLOQ。本研究結(jié)果還顯示，UPLC-MS/MS檢測結(jié)果與ELISA的差異較大，ELISA不但可檢出血清中的哇巴因，且檢出的正常對照者與高血壓患者的血清哇巴因水平有明顯差異。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有特異性高、準(zhǔn)確度好、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)勢。本研究建立的UPLC-MS/MS檢測哇巴因的方法在臨床應(yīng)用中得到陰性的檢測結(jié)果。但這種陰性結(jié)果并非首次報(bào)道。早在1994年，LEWIS等[9]的研究結(jié)果顯示高效液相色譜檢測不到人血漿中的哇巴因。BAECHER等[16]采用UPLC-MS/MS在人血漿中也未能檢測到內(nèi)源性哇巴因。上述方法的檢測結(jié)果均未與免疫法進(jìn)行比較。為此，本研究采用UPLC-MS/MS和ELISA同時(shí)檢測血清哇巴因水平并作比較，2種方法的檢測結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]一致。

為了研究2種方法檢測結(jié)果的差異，本研究檢測了新鮮血清和血漿樣本，結(jié)果顯示UPLCMS/MS仍未檢測到哇巴因，排除了因血清久置而導(dǎo)致的哇巴因降解以及血清與血漿的差異。在血清中添加哇巴因標(biāo)準(zhǔn)品后采用ELISA檢測，結(jié)果顯示檢測結(jié)果并未隨著哇巴因添加水平的升高而升高，而同一批樣本采用UPLC-MS/MS檢測則可準(zhǔn)確地檢出添加的哇巴因。考慮到2種方法檢測原理的差異，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測特異性更強(qiáng)，免疫法檢測小分子生物標(biāo)志物容易受到類似物的干擾，且方法的重復(fù)性受到諸如制備抗體的差異等多種因素的影響。綜上所述，我們認(rèn)為內(nèi)源性結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)可能是導(dǎo)致ELISA產(chǎn)生陽性結(jié)果的主要原因，UPLC-MS/MS產(chǎn)生陰性檢測結(jié)果的原因可能受制于其檢測限，但鑒于本研究檢測結(jié)果與BAECHER等[10]的研究結(jié)果一致，因此推測人血清中可能不存在哇巴因這一物質(zhì)，具體原因有待于更進(jìn)一步的深入研究。