CS-5100全自動血凝儀檢測抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性的性能驗證

李 雯，何愛麗， 張 雯，周 挺

（西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710004）

抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，ATⅢ）是人體內主要的生理性血漿抗凝物質，主要由肝臟合成。血液中抗凝血酶與凝血酶結合形成凝血酶—抗凝血酶復合物[1]，從而滅活凝血酶，起到控制血液凝固的作用。蛋白C（protein C，Pc）系統在凝血酶產生的同時被激活，滅活FVa和FⅧa，阻斷凝血過程；蛋白S（protein S，Ps）是一種維生素K依賴性酶原，可協同活化Pc，抑制血液凝固。因此，檢測ATⅢ、Pc和Ps活性狀態對血栓性疾病、心肌梗死、腦血管疾病、彌散性血管內凝血、肝臟疾病、腎病綜合征、外科手術以及抗凝藥物的檢測都具有重要意義。本研究根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）系列指南文件對CS-5100全自動血凝儀（簡稱CS-5100）及配套試劑檢測ATⅢ、Pc和Ps活性進行性能驗證。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取在西安市交通大學第二附屬醫院就診的患者及體檢健康者，參照 CLSI H21-A5文件[2]的要求，用0.109 mmol /L 檸檬酸鈉抗凝管采集患者靜脈血2 mL，1 500×g離心10 min，分離出乏血小板血漿，要求標本無溶血、凝固、乳糜現象，血細胞比容＜55%。

1.2 儀器與試劑

CS-5100（日本Sysmex公司）及配套試劑。正常水平定值質控品批號為507722，異常水平定值質控品批號為509986，ATⅢ試劑批號為 45762，Pc試劑批號為 45888，Ps試劑批號為45769。

1.3 性能驗證方法

1.3.1 不精密度[以變異系數（coefficient of variation，CV）表示]驗證 （1）批內不精密度：參照CLSI EP15-A2文件要求[3]，取2個水平的混合血漿，按照常規方法連續測定20次ATⅢ、Pc和Ps，計算各項目的x 、s和CV。（2）日間不精密度：取2個水平的混合血漿，各分裝成5份標本，保存于-70 ℃，每天測定4次，分2批測定，每批間隔時間2 h，連續測定5 d，記錄每次 ATⅢ、Pc和Ps的測定結果，計算CV。按照廠家標準，要求ATⅢ活性批內不精密度 ＜1.3%，日間不精密度＜2.7%，Pc活性批內不精密度 ＜0.4%，日間不精密度＜1.9%，Ps活性批內不精密度＜1.9%，日間不精密度＜4.1%。

1.3.2 準確度驗證 參照廠家提供的定值質控品使用說明書，使用1.0 mL的注射用水將正常和異常2個水平的定值質控品進行復溶，混勻，室溫（25±2）℃穩定20～30 min后進行檢測。同時參照CLSI EP15-A2文件要求[3]，重復測定ATⅢ、Pc和Ps2個水平的定值質控品各3次，將測定值與靶值進行比較，計算相對偏移，相對偏移=（靶值-測定值）/靶值×100%。查閱Westgard生物學CV要求，ATⅢ活性偏移±4%，Pc活性偏移±13.9%，Ps活性偏移±15.9%。

1.3.3 線性驗證 參照CLSI EP6-A文件[4]，選取高、低2個水平的混合血漿，將低水平和高水平標本分別按4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4的比例混合，得到5份線性試驗標本，每個稀釋度重復測定3次，計算x。 將5對實測值與理論值作直線回歸，得到回歸方程Y=aX+b和r2值。回歸方程斜率在（1±0.05）范圍內、r2≥0.95判定為合格。

1.3.4 參考區間驗證 廠家試劑說明書提供的參考區間分別為ATⅢ79.4%～112.0%、Pc 70.0%～140%、Ps 60.0%～130.0%。參照CLSI C28-A2文件[5]，收集20名體檢健康者血漿，排除伴有血液系統疾病、心腦血管疾病、肝臟疾病、肺栓塞、服用抗凝藥物者，測定標本并計算R值（R=結果落在參考區間內的樣本數/總樣本數），以R≥0.9為驗證通過。

1.3.5 攜帶污染驗證 參照CLSI H57-A文件[6]，高值標本污染：將低值標本（N）置于1和3 位置，高值標本（A）置于2位置，每個標本測3次，記錄結果，分別標注為N1、N2、N3、A1、A2、A3 、N4、N5、N6。攜帶污染率=[N4-x（N1，N2，N3）] /x （N1，N2 ，N3）。尚未查到對3種抗凝蛋白活性檢測攜帶污染率有要求的指南性文件，僅有相關血凝儀性能驗證文獻[7-8]報道各項目CV＜10%。因此以攜帶污染率＜10%為符合要求。

1.4 統計學方法

采用 Excel 2003軟件進行數據統計分析。

2 結果

2.1 精密度驗證

ATⅢ、Pc和Ps批內不精密度和日間不精密度驗證結果均符合試劑說明書要求。見表1。

2.2 準確度驗證

ATⅢ、Pc和Ps各項目檢測結果均落在質控品標示的允許范圍內，偏移符合Westgard生物學CV要求。見表2。

表1 批內及日間不精密度驗證 （%）

表2 準確度驗證 （%）

2.3 線性驗證

ATⅢ線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=0.980 1X-0.259，r2=0.999 7。Pc線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=0.970 4X+0.986，r2=0.996 7。Ps線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=0.982 2X+2.789 4，r2=0.994 5。均符合線性回歸方程的斜率在（1±0.05）范圍內以及r2≥0.95的要求。見圖1～圖3。

2.4 參考區間驗證

20名體檢健康者ATⅢ、Pc、Ps的檢測結果均在廠家試劑說明書提供的參考區間內，驗證通過。見表3。

2.5 攜帶污染試驗

ATⅢ高值對低值的污染所引起的相對偏差為0.71%，Pc高值對低值的污染所引起的相對偏差為-0.63%，Ps高值對低值的污染所引起的相對偏差為1.11%，攜帶污染率可接受。見表4。

圖1 ATⅢ的線性驗證

圖2 PcⅢ的線性驗證

圖3 Ps的線性驗證

表3 參考區間驗證 （%）

表4 高值樣本對低值樣本的攜帶污染率 （%）

3 討論

血栓形成是導致心、腦和外周血管事件的最后關鍵環節，是致死或致殘的直接原因。血栓性疾病幾乎涵蓋所有臨床科室，其發病率高居各種疾病之首。在血栓性疾病中，靜脈血栓的發生率比動脈血栓高4倍，但只有11%～15%的患者在生前被明確診斷。大多數靜脈血栓沒有癥狀，易被漏診、誤診。 ATⅢ、Pc和Ps活性檢測的開展對于血栓性疾病，尤其對于易栓癥的臨床篩查具有重要意義。易栓癥并不一定指疾病，可以是生理或病理狀態，是指存在抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等遺傳性或獲得性缺陷，或者存在獲得性危險因素而具有高血栓栓塞傾向[9]。易栓癥的血栓栓塞類型主要為靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）。在我國，最常見的易栓癥類型是遺傳性易栓癥。有研究對672例VTE患者的相關危險因素進行了分析，其中有94例VTE患者檢測了抗凝蛋白，Pc缺乏占13.85%、Ps缺乏占5.3%、AT缺乏占5.3%，合計占24.4%[10]。因此，ATⅢ、Pc和Ps的活性檢測對易栓癥篩查具有重要意義。而國內大多數醫院對易栓癥的篩查還停留在常規凝血4項和空腹同型半胱氨酸以及抗磷脂抗體的檢測上，僅有部分醫院開展ATⅢ、Pc和Ps的活性以及凝血因子的檢測。

本研究參考CLSI系列指南文件對CS-5100及配套試劑檢測ATⅢ、Pc和Ps活性的性能進行了驗證。結果顯示ATⅢ、Pc和Ps的批內不精密度和日間不精密度均符合廠家要求，檢測重復性良好。準確度為一種定性的概念，有報道[11]指出準確度驗證的定值參考物來源主要有以下4種：（1）可溯源至美國病理學家協會及美國國家標準和技術研究院的定值新鮮冰凍人血清；（2）實驗室室間質評物；（3）從能力比對實驗中獲得的參考物；（4）廠家提供的正確度確認物或質控物。本研究采用第4種，重復測定3次，計算偏移。在線性評價驗證中，本研究參照CLSI EP6-A指南[4]，采用多項式回歸作為分析線性的評價方法，結果表明ATⅢ、Pc和Ps實測值和理論值之間具有良好的線性關系。參考區間驗證結果顯示，20名體檢健康者的ATⅢ、Pc和Ps的檢測結果均在廠家說明書提供的參考區間內，參考區間驗證通過。但應注意的是，接受實驗室的操作必須和原始參考值研究的分析前和分析中各因素盡量保持一致，否則參考區間轉移毫無意義。攜帶污染率是指樣本檢測間以及試劑間引起攜帶污染的概率，本研究僅驗證了主要樣本間的攜帶污染率。結果顯示ATⅢ、Pc和Ps的攜帶污染率分別為0.71%、-0.63%和1.11%。

CS5100性能驗證報道很多，但對ATⅢ、Pc和Ps性能驗證較少。目前尚未查到國內外在ATⅢ、Pc和Ps活性檢測性能驗證和質量控制方面的指南性文件。因此，期望相關指南文件不斷完善，使各級實驗室抗凝蛋白活性性能驗證能規范化開展，為臨床提供可靠的檢測結果。