反相高效液相色譜法測定五子補腎強身丸中淫羊藿苷含量

黃 瑋，姚強文，包明燕

（1．四川省資陽市食品藥品檢驗檢測中心，四川 資陽 641300； 2．四川金輝藥業有限公司，四川 資陽641300； 3．四川省資陽市第一人民醫院，四川 資陽 641300）

五子補腎強身丸為簡陽市中醫醫院臨床經驗方劑，為由枸杞子、菟絲子、淫羊藿[1]、制何首烏、當歸等11味中藥制成的大蜜丸，主治補益肝腎、養血生精，用于腎虛精少不育，陽痿早泄、性功能低下、腰脊酸痛、神疲乏力等腎虛體弱癥[2]。參考文獻[3-10]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定五子補腎強身丸中淫羊藿苷的含量，快速準確。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司，包括VWD檢測器和LC solution工作站）；XS205型電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516，含量為94．2%，中國食品藥品檢定研究院）；五子補腎強身丸（大蜜丸，每丸重 9 g，醫院自制制劑，批號分別為150623，151014，160405，160801，161120，170309）；乙醇(分析純，成都科龍化學試劑廠）；乙腈(色譜純，Fisher公司）；試驗用水（四川科倫藥業股份有限公司，批號為M18011302）；滅菌注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Zorbax EclipsePlusC18柱(250 mm×4．6mm，5 μm）；流動相：乙腈(A）-水(B），梯度洗脫（0～8 min時 10%A，9～35 min時 10%A→35%A，35～40 min時10%A）；流速：1．0mL/min；檢測波長：270nm；柱溫：30℃；進樣量：5μL。在此色譜條件下，理論板數按淫羊藿苷峰計應不低于5000，相鄰峰之間分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

稱取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，即得淫羊藿苷對照品質量濃度為0．103 4 g/L的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2．0 mL，置25 mL容量瓶中，加稀乙醇配制成約為10 μg/mL的標準品溶液，即得對照品溶液。剪碎本品，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率為300 W，頻率為 60 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，用0．45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。按處方比例和樣品制備工藝制成不含淫羊藿的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察[11-15]

專屬性試驗：取2．2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，進樣測定。色譜圖中，在與對照品溶液淫羊藿苷色譜峰處，陰性對照品溶液無此峰出現，表明其對樣品測定無干擾。

線性關系考察：精密吸取對照品貯備液0．25，0．50，1．00，2．00，3．00，5．00 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，即得1～5號標準溶液，分別精密吸取上述系列標準溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，以對照品質量濃度(X，μg/mL）為橫坐標、峰面積(Y）為縱坐標繪制標準曲線，得淫羊藿苷回歸方程Y=1．422X+2．343，r=0．999 6(n=6），進樣質量濃度線性范圍為 2．104 ～407．300 μg/mL。

精密度試驗：精密吸取2．2項下對照品溶液5 μL，連續進樣6次，記錄峰面積。結果淫羊藿苷峰面積的RSD為0．56%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復性試驗：取樣品（批號為160405）適量，共6份，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量。結果的RSD為0．92%(n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為160405）適量，按2．2項下方法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定。結果的RSD為0．78%(n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為160405，含量為0．103 mg/g）6 份，每份約 2 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品貯備液80%，100%，120%，各2份，分別按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

分別取6批樣品，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，采用外標法計算樣品含量。結果 批 號 為 150623，151014，160405，160801，161120，170309樣品中淫羊藿苷含量分別為每丸0．973，1．022，0．924，0．986，1．055，0．947 mg。

3 討論

檢測成分選擇：該復方制劑的主要藥味有枸杞子、菟絲子、淫羊藿、制何首烏、當歸等，其中淫羊藿為方中主藥，投藥量較大，其主要功效為補腎陽、強筋骨、祛風濕，用于治療陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣，更年期高血壓。與淫羊藿補腎陽、強筋骨功效主治相關的藥理作用為增強性腺功能，調節機體免疫功能，促進骨生長，延緩衰老等，其還具有強心、降血壓、抗心律失常、增加腦血流量、抑菌、抗病毒、抗炎、調血脂、抗腫瘤等多種作用，具有較高的藥用和保健價值。

色譜條件選擇：本研究中采用梯度洗脫法分離的成分，40 min內完成分離，淫羊藿苷分離效果良好，符合含量測定要求。本研究中通過二極管陣列檢測器考察所測物質紫外吸收度，在270 nm波長處有較大吸收，故選擇270 nm作為檢測波長。流動相比較了乙腈-水和乙腈-0．05%磷酸系統，乙腈-水梯度洗脫各色譜峰均實現基線分離，能達到定量要求。

稀釋溶劑選擇：標準品和樣品的稀釋溶劑曾選擇水、稀乙醇、乙醇、50%甲醇和甲醇分別檢測，發現用稀乙醇檢測時樣品雜質峰較少，且淫羊藿苷出峰時間無干擾。

提取條件優化：本研究中對不同提取方式（加熱回流和超聲）、提取溶劑（稀乙醇、70%乙醇溶液和乙醇）及提取時間（30，45，60 min）和取樣量（0．5，1．0，2．0 g）進行考察，最終確定，稱取樣品2．0 g，加稀乙醇50 mL，超聲提取30 min為最佳提取條件。

耐用性考察：本研究中分別考察了日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀、美國安捷倫1260型高效液相色譜儀和3種同類填料不同品牌的色譜柱進行淫羊藿苷的可重復性測定，并驗證方法的可重復性。結果表明，該方法適用性及耐用性良好。

該醫院制劑現行標準為《四川省食品藥品監督管理局標準 SZBZ20081208-11(Z）》[2]，僅有顯微鑒別、當歸藥材的薄層色譜鑒別，未對含量進行控制，不能全面反映該制劑的質量水平，且國內尚未見對五子補腎強身丸中淫羊藿苷有效成分含量進行控制的報道。本研究中建立的方法可測定五子補腎強身丸淫羊藿苷成分的含量，方法簡便、快速，可用于五子補腎強身丸的含量測定，為綜合評價其質量提供準確、快速的定量分析方法，也為五子補腎強身丸的質量控制提供依據。在進行化學成分含量測定時，有2個不明物質的峰較高，從樣品測定結果來看，這3種成分的含量均大于每丸1．0 mg，有待進一步深入研究。