大黃瀉火散質量標準改進研究

繆 紅 ，徐丹洋 ，蘇 健 △

（1．江蘇省南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226010； 2．江蘇省南通市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 南通 226006）

大黃瀉火散現行質量標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第十九冊）》[1]，組方為大黃、薄荷、炙甘草、芒硝、連翹、黃芩、炒梔子仁，粉碎成細粉，過篩，混勻，具有清熱瀉火的功效，臨床用于胸膈煩熱、口渴便秘。大黃瀉火散原標準只有性狀及大黃中蒽醌類及芒硝的鑒別項，缺少有效的質控項目。由于大黃和連翹是方中主藥，參考《中國藥典》及文獻[2]，選擇大黃中大黃素、大黃酚及連翹中的連翹苷作為質控指標。為了提高藥品質量標準，本研究中建立并增加了大黃、薄荷、炙甘草、連翹、黃芩、炒梔子仁的顯微鑒別，炙甘草和黃芩的薄層色譜（TLC）鑒別，以及大黃中大黃素、大黃酚及連翹中的連翹苷的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（戴安儀器公司）；KQ-300DB型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水機（Millipore公司）；CPA225D 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BX51-DP72型顯微成像系統（奧林帕斯公司）；TUBE-mill 100 C S025型粉碎機（IKA公司）；藥典篩（湖南省常德粒度分析儀器廠）。

1.2 試藥

對照品大黃素（批號為110756-201512）、大黃酚（批號為 110796-201621）、連翹苷（批號為 110821-201615）、黃芩苷（批號為 110715-201619）、黃芩素（批號為 111595-201607）、甘草酸銨（批號為 110731-201619），對照藥材黃芩（批號為120955-201309）和甘草（批號為120904-201519），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G預制板(默克公司）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純；本試驗所用樣品均為飲片粉碎后混勻自制；飲片分別購自南通三越飲片公司及同仁堂，經南通市食品藥品監督檢驗中心葛建華主任中藥師鑒定為正品。自制樣品6批次，1～3號樣品的飲片均來源于南通三越飲片公司，4～6號樣品的飲片來源于同仁堂公司。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別[3]

取1～6號樣品細粉，分別以水合氯醛透化制片，置顯微鏡下觀察。可見，草酸鈣簇晶較多，類圓形，直徑20～160 μm，棱角大多短鈍；偏光顯微鏡下，結晶亮黃白色間多彩狀（大黃）。非腺毛1～8個細胞，多彎曲，壁厚，具疣狀突起（薄荷）；顯微多成束，周圍細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（炙甘草）。果皮表皮細胞表面觀呈類圓形或類方形，內充滿黃棕色物質（連翹）。韌皮纖維單個散在或成束，梭形，壁厚，溝孔細；偏光顯微鏡下，呈亮黃白色（黃芩）。種皮石細胞黃色或淡棕色，類長方形、梭形、長橢圓形或不規則形，壁厚，紋孔大；偏光顯微鏡下，石細胞呈亮黃色（炒梔子仁）。6個組分的顯微特征明顯，方法重復性良好。詳見圖1。

圖1 顯微鑒別圖

2.2 TLC鑒別

黃芩：取樣品細粉 5g，加乙酸乙酯 -甲醇（3∶1）30mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材0．5 g，同法制成對照藥材溶液。取缺黃芩的陰性樣品5 g，同法制成陰性對照品溶液。取黃芩苷對照品、黃芩素對照品分別制成每1 mL約含1 mg的對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]，分別精密吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液各5 μL及對照品溶液2 μL，分別點于同一含1%草酸的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。1～6號樣品分別做相應的陰性樣品。結果，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，斑點清晰可見。缺黃芩陰性樣品均對相應樣品測定無干擾，且6批樣品及相應陰性樣品的結果均一致（圖2 A）。

炙甘草：取樣品細粉5 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取缺炙甘草陰性樣品5 g，同法制成陰性對照品溶液。取甘草酸銨對照品制成每1 mL約含1 mg的對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]，分別精密吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液及對照品溶液各2 μL，分別點于同一含1%氫氧化鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。1～6號樣品分別做相應的陰性樣品。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰可見。缺甘草陰性樣品均對相應樣品測定無干擾，且6批樣品及相應陰性樣品的結果均一致（圖2 B）。

圖2 薄層色譜圖

2.3 大黃含量測定

2．3．1 溶液制備

取供試品細粉3 g，精密稱定，混勻，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質量，浸泡1 h，水浴加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各約含50 μg的混合溶液，即得混合對照品溶液。取缺大黃陰性樣品細粉，與供試品溶液同法制成缺大黃陰性對照品溶液。

2．3．2 色譜條件[5]與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0．1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～15 min時71%A→71%A，15～45 min時 71%A→85%A）；流速：1．0 mL/min；檢測波長：254 nm。6 批樣品和相應陰性樣品同法測定。在此色譜條件下，供試品溶液中大黃素、大黃酚均能得到較好地分離，陰性樣品無干擾，詳見圖3。

2．3．3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取大黃素（51．2 μg/mL）、大黃酚（49．8 μg/mL）混合對照品溶液 1，2，5，10，20，25 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，ng）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為，大黃素Y=2．895X-0．021（r=0．999 8），大黃酚Y=3．958X-7．062（r=0．999 8）。結果表明，大黃素、大黃酚進樣量分別在51．2～1280．0ng和49．8～1 250．0 ng范圍內與峰面積線性關系良好。

圖3 高效液相色譜圖

精密度試驗：取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果大黃素、大黃酚的RSD分別為 0．51%和0．27%(n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取6號樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定。結果大黃素和大黃酚峰平均含量分別為0．33 mg/g和0．69 mg/g，RSD分別為0．91%和 1．24%(n=6），表明方法重復性良好。

專屬性試驗：陰性干擾試驗，按處方配比制成缺大黃陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液，按擬訂色譜條件進行測定。結果在大黃素、大黃酚處未出現色譜峰，（圖3），缺大黃陰性樣品無干擾。峰純度檢查，試驗中采用二極管陣列檢測器對樣品中大黃素、大黃酚峰進行了色譜峰純度檢查，均未檢測到雜質。

加樣回收試驗：取已知含量的6號樣品9份，精密加入大黃素、大黃酚對照品溶液，按2．3．1項下方法制備溶液，按擬訂色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表1。

穩定性試驗：取同一批3號樣品制備的供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，12，24 h 時進樣 10 μL。結果大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0．47%和 0．58%(n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2．3．4 樣品含量測定

取1～6號樣品，按2．3．1項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，用外標法計算含量。結果見表2。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗結果(n=9）

表2 樣品含量測定結果（mg/g）

2.4 連翹含量測定

2．4．1 溶液制備

取6號樣品細粉3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，浸漬過夜，超聲處理(功率為 250 W，頻率為 40 kHz）25 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁1%拌勻，加在中性氧化鋁柱（100～120 目，1 g，內徑為 1～1．5 cm）上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50% 甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液[6]。取連翹苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL約含50 μg的溶液，即得對照品溶液。取缺連翹陰性樣品細粉，與供試品溶液同法制成缺連翹陰性對照品溶液。

2．4．2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0．1%磷酸溶液（22 ∶78）；流速：1．0 mL/min；檢測波長：205 nm。6批樣品和相應陰性樣品同法測定。在該色譜條件下，供試品溶液中連翹苷能得到較好地分離，陰性樣品無干擾，詳見圖4。

2．4．3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取連翹苷（54．8 μg/mL）對照品溶液 1，2，5，10，20，25 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，ng）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=6．293X-0．232，r=0．999 9(n=6）。結果表明，連翹苷進樣量在54．8～1 370．0 ng范圍內與峰面積線性關系良好。

圖4 高效液相色譜圖

精密度試驗：取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果連翹苷的RSD為0．45%(n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取6號樣品6份，按2．4．1下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定。結果連翹苷平均含量為0．90 mg/g(n=6），表明方法重復性良好。

專屬性試驗：陰性干擾試驗，按處方配比制成缺連翹陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液，按擬訂色譜條件進行測定。結果，在連翹苷峰處未出現色譜峰(圖4），說明按本試驗條件測定，缺連翹陰性樣品無干擾。峰純度檢查，試驗中采用二極管陣列檢測器對樣品中連翹苷峰進行了色譜峰純度檢查，均未檢測到雜質。

加樣回收試驗：取已知含量的6號樣品9份，精密加入連翹苷對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表3。

表3 連翹苷加樣回收試驗結果(n=9）

穩定性試驗：取同一批3號樣品制備的供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，12，24 h 時進樣 10 μL。結果連翹苷峰面積的RSD為0．68%(n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2．4．4 樣品含量測定

取1～6號樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，用外標法計算含量。結果樣品編號為1～6 的連翹苷的含量分別為 0．783，0．654，0．492，0．922，0．556，0．920 mg/g。

3 討論

由于本試驗樣品均是自制混合細粉，故顯微鑒別、薄層色譜鑒別及含量測定的每個批次的陽性樣品均對應一個陰性樣品，以排除陰性干擾。結果表明，所有批次的陰性樣品對在方法學考察下的陽性樣品均無干擾，表明方法可行、可靠。

薄層色譜鑒別考察因素包括不同廠家的硅膠G預制板、不同的溫濕度、展開系統及飽和度，以及樣品處理等。不同廠家的硅膠粒度、性質、黏合劑和制版技術都會導致色譜行為產生差異。溫度高，一般Rf值也高。溫度還影響有機試劑的蒸發程度，從而改變了展開劑的比例。濕度影響薄層板的吸附能力，樣品的提取決定了斑點之間能否達到滿意的分離效果[7]。結果表明，甘草薄層色譜鑒別在室溫15℃、相對濕度50%的條件下，用默克公司的預制板能達到較好的分離度，且展開缸和薄層板是否飽和對甘草薄層鑒別影響較大。黃芩色譜鑒別若采用2015年版《中國藥典（一部）》的方法，不僅會造成嚴重的拖尾現象，且陰性樣品干擾，達不到鑒別效果。黃芩色譜鑒別對硅膠G板的選擇性不強，在室溫15℃、相對濕度50%的條件下，青島海洋公司和默克公司的硅膠G預制板都能很好地分離，甲酸能很好地抑制斑點的拖尾現象。

含量測定方法研究過程中，大黃的總蒽醌含量遠高于游離蒽醌，采用酸水解考察總蒽醌含量應更合理[8-9]，但在方法考察的過程中，由于酸水解過程中產生的副產物對大黃酸及大黃素峰位置均有干擾，且酸水解的酸度和時間對蒽醌苷元有影響[10]，故僅考慮游離蒽醌的含量測定。游離蒽醌的測定過程中，大黃酸峰位置干擾明顯，大黃素甲醚含量較低且保留時間較長，故只考察大黃素及大黃酚的含量測定。提取過程考察了浸泡1 h后超聲提取30 min和60 min或加熱回流提取1 h和2 h，并進行方法學考察和耐用性試驗。流動相參考2015年版《中國藥典（一部）》大黃品種項下方法。不同品牌色譜柱[Agilent Ecilpse Plus C18柱，Waters Symmetry C18柱，Purospher Star(Merck）]和不同品牌的液相色譜儀器（戴安U3000，沃特世e2695），測得大黃中大黃素、大黃酚的RSD均在2．0%之內，說明本方法測定耐用性好。設計連翹苷的含量來控制連翹的質量。連翹的品質雖分為青翹和老翹，但藥典中規定連翹苷的限度一致，而市場上流通的老翹中連翹苷的含量很難達到藥典限度[11]，故設定連翹苷的含量來控制連翹的品質很有必要。連翹苷的含量測定方法研究中，提取方法參考2015年版《中國藥典（一部）》連翹品種項下方法，流動相考察乙腈-水和乙腈-0．1%磷酸溶液。不同品牌色譜柱[Agilent Ecilpse Plus C18柱，Waters Symmetry C18柱，Purospher Star(Merck）]和不同品牌的液相色譜儀（戴安U3000，沃特世e2695），測得連翹中連翹苷的RSD在2．0%之內，說明本方法測定耐用性好。