IR780白蛋白納米粒的制備、表征及體外抗腫瘤活性研究*

李艷麗 ，孫增先 ，王添艷 ，2，楊廣勝 △

（1．徐州醫科大學附屬連云港醫院·連云港市第一人民醫院藥學部，江蘇 連云港 222000； 2．徐州醫科大學藥物分析教研室，江蘇 徐州 221004）

IR780是一種親脂性陽離子型小分子近紅外熒光吸收劑[1]，屬于吲哚三碳菁類染料，在吸收波長為780 nm處有最大吸收峰，一般以碘化物的形式存在[2]。相比于其他碳菁類染料，IR780分子結構中引入的氯原子，提高了整個分子的量子產率，且降低了IR780在溶液中的熒光淬滅率和分子聚合反應率，具備深入穿透腫瘤組織內部，靶向聚集于腫瘤細胞內，提高病灶組織的信號對比度等特點[3]。在近紅外光照射下，IR780可通過產生的活性氧自由基和大量的熱殺死腫瘤細胞，但由于其脂溶性高、體內毒性大，光學性質不穩定，已發生光漂白及生物相容性差等缺點，極大地限制了臨床應用。納米載藥系統是將包載的藥物靶向運送到特定的腫瘤部位等，降低藥物在其他正常組織器官中的分布，具有增強藥物溶解性和腫瘤靶向性，提高藥效和降低藥物毒副作用等特點[4-5]。制備納米粒的載體材料有很多，其中牛血清白蛋白載藥量高、無抗原性、生物相容性好[6-7]。此外，白蛋白納米粒可通過控制其粒徑大小特定靶向于肝臟和肺組織，從而實現肝臟等組織腫瘤的靶向治療，揭示白蛋白納米粒作為生物大分子藥物載體有著各種潛在的優越功能[8-11]。為增強IR780的水溶性和光熱的穩定性，降低其在體內的毒性，本研究中將IR780包載在白蛋白納米粒中，研究負載IR780白蛋白納米粒的制備、表征、光熱效應及對人的結腸和直腸癌上皮細胞Caco-2體外生長抑制效果，探討白蛋白作為近紅外熒光染料IR780載體的潛在優勢，為進一步研究其體內靶向分布和光熱治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：JEM-100SX型高分辨透射電子顯微鏡(日本 JEOL公司）；LS55紫外-熒光分光光度計（美國Perkinelmer）；380ZLS 粒徑電位分析儀（Nicomp，美國）；離心機（日立儀器有限公司）；酶標儀（美國Bio-Rad公司）；81-2恒溫磁力加熱攪拌器 (上海梅穎浦電子儀器有限公司）；MS304T型電子分析天平(德國梅特勒公司）；冷凍離心機 (Centrifuge 5415R，德國 Eppendorf公司），5804R高速冷凍離心機(德國Eppendoff公司）；倒置顯微鏡 (40CFL Axiovert 40，德國 Carl Zeiss公司）；785 nm激光器（MW-GX-785/2000mW，長春飛秒科技有限公司）。

試藥與細胞：IR780碘化物（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為20170420，純度為99．9%）；牛血清白蛋白（分析純，美國Gibco公司，批號為20150703）；95%戊二醛、二甲亞砜、甲醇、無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。優級胎牛血清（美國Gibco公司，批號為20170503）；噻唑藍（MTT，上海碧云天生物技術有限公司，批號為 20170504）；臺盼藍（批號為T108744），1640 培養基（批號為 20170705），均由徐州博利達生物科技有限公司提供；人結腸和直腸癌上皮細胞Caco-2由中科院上海細胞庫提供。

1.2 方法

載IR780白蛋白納米粒的制備：精密稱取一定量IR780和牛血清白蛋白BSA，將IR780先溶于0．2 mL甲醇中，與BSA混溶于3 mL蒸餾水中，超聲溶解，向溶液中緩慢滴加pH=9．0的磷酸鹽緩沖液，再以2 mL/min的速率滴加無水乙醇，邊加邊攪拌，加入0．3 mL 8%戊二醛溶液固化6 h，減壓蒸餾除去乙醇和甲醇，沉淀用蒸餾水洗滌3次，20 000 r/min高速離心10 min，沉淀真空干燥，得白蛋白納米粒粉末，低溫保存，待用。

白蛋白納米粒形態和粒徑分布觀察：取上述條件下制備的白蛋白納米粒凍干粉，加純水稀釋至1 mL，采用激光納米粒度儀測定其粒徑。另取適量上述白蛋白納米粒溶液，滴在覆有支持膜的銅網上，2%磷鎢酸負染干燥后置透射電鏡下拍照，觀察其外表形態。

白蛋白納米粒的載藥量和包封率測定：通過紫外分光光度計測定溶液中IR780的含量。配制質量濃度為1．0，2．0，4．0，8．0，10．0，16．0，20．0 μg/mL 的 IR780 溶液，用紫外分光光度計(780 nm）測量其吸光度，并繪制標準曲線。精密稱取一定量的白蛋白納米粒，加入9%醋酸溶液沸水浴2 h，破壞白蛋白納米粒，得澄清透明溶液，測定IR780的吸光度，并用標準曲線計算IR780的濃度、載藥量及包封率。計算公式：載藥量=納米粒中藥物的含量/納米粒的質量×100%，包封率=納米粒中藥物的含量/藥物的投藥量×100%。通過以下公式計算載藥量和包封率。載藥量（%）=納米粒中IR780的質量/納米粒的質量×100%，包封率（%）=納米粒中IR780的質量/IR780的投入量×100%。

白蛋白納米粒的光熱效應考察：分別稱取一定量的白蛋白納米粒，按照包載的IR780質量濃度配置成10，20，40，60μg/mL，785nm 激光器照射 5min（1．5W/cm2），觀察溫度上升情況。

體外細胞毒性試驗：取對數生長期的Caco-2細胞，將該細胞懸液按每孔 100 μL（4 ×104/mL）接種至96孔板中，將96孔板置細胞培養箱中培養過夜，設置白蛋白納米粒±激光照組，然后分別加入不同濃度白蛋白納米粒和游離 IR780溶液，質量濃度為 0．1，0．5，1．0，2，4，8，10 μg/mL IR780，每個質量濃度設置 6 個復孔，不加藥物為空白對照組，培養24 h后終止藥物孵育，換用新的培養基，激光照射組用785 nm激光器照射3 min（1．5 W/cm2），繼續培養 6 h，然后棄去培養基，每孔加入 MTT 溶液 20 μL（5 mg/mL），4 h 后終止培養，加入100 μL二甲亞砜，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處測定每孔的吸光度值（OD），細胞的存活率（%）=（OD實驗組）/（OD對照組）×100%。

Caco-2細胞臺盼藍染色：取對數生長期的Caco-2細胞，將該細胞懸液按每孔1 mL（5×103/mL）接種至24孔板中培養過夜，對照組為正常的細胞，未加任何干預措施，實驗組為加入IR780 5 μg/mL的白蛋白納米粒，培養6 h后，棄去培養基，PBS清洗3次，加入無血清培養基，785 nm激光器照射3 min，繼續培養6 h后，加入胰酶消化貼壁細胞，制備單細胞懸液，并適當稀釋。然后將細胞懸液與0．4%臺盼藍溶液以9∶1混合均勻（終濃度0．04%），在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況。

2 結果

2.1 白蛋白納米粒形態和粒徑分布

所制備的包載IR780白蛋白納米粒的透射電鏡圖見圖1，粒徑分布見圖2。可見，白蛋白納米粒形態比較圓整，分散性良好、無黏連，可使白蛋白納米粒在體內有效躲避網狀內皮系統的吞噬，并可通過高滲透長滯留效應(EPR）蓄積到腫瘤組織中[12]。粒度分析儀檢測結果表明白蛋白納米粒的平均粒徑為（236 ±8．4）nm（n=6）。

圖1 透射電鏡下白蛋白納米粒粒徑分布(×30 000）

圖2 白蛋白納米粒粒徑分布

2.2 白蛋白納米粒載藥量和包封率測定

利用紫外分光光度計測量并繪制IR780的標準曲線，以 UV 吸光度(Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，得Y=0．077 2X+0．041 5，R2=0．999 7（n=3），表明白蛋白納米粒質量濃度在1．0～20．0 μg/mL范圍內與IR780線性關系良好。測定白蛋白納米粒中IR780的吸光度值，計算得到 IR780的包封率為（72．43±6．45）%，載藥量為（4．38 ±0．35）%。

2.3 白蛋白納米粒光熱效應考察

IR780具有近紅外光吸收的升溫特性，考察了不同濃度的白蛋白納米粒的光熱升溫效果。由圖3可見，蒸餾水對照組經過近紅外光照射后，溶液溫度變化不大，300 s內溫度僅升高了3℃；白蛋白納米粒具有較強的光熱效應，隨著光照時間的延長，溶液的溫度逐漸升高，時間越長溫度越高，且隨著IR780濃度的增加，溫度也逐漸增高，顯示白蛋白納米粒具有較強的濃度依賴性升溫效果。此外，60 μg/mL IR780的白蛋白納米粒經過激光照射后，溫度可升高至42℃，據報道，42℃的溫度即為殺死腫瘤細胞的致死溫度[13]。

2.4 體外細胞毒性試驗

圖3 白蛋白納米粒的光熱效應考察（785 nm，1．5 W/cm2，5 min）

利用MTT法分別檢測游離IR780和白蛋白納米粒對Caco-2細胞的毒性作用。由圖4 A可見，相比于游離IR780組，近紅外光照射IR780組對Caco-2的細胞毒性作用增強，表明光熱效應可增強IR780對Caco-2的細胞毒性作用。由圖4 B可知，與相同濃度的游離IR780相比，白蛋白納米粒對Caco-2細胞的毒性作用明顯增強，隨著IR780的濃度不斷增大，細胞毒性也隨之增加，白蛋白納米粒對Caco-2細胞的半數抑制濃度(IC50）為（0．456 ±0．2）μg/mL，這可能是由于白蛋白納米粒增強細胞對IR780的攝取，導致細胞白蛋白納米粒的細胞毒性作用增強。此外，白蛋白納米粒經過激光照射后，對Caco-2的細胞毒性作用也進一步增加，細胞生存率明顯降低，IC50為0．215 μg/mL，表明近紅外光照射可進一步增加白蛋白納米粒對Caco-2細胞的毒性。

圖4 體外細胞毒性研究

2.5 Caco-2細胞臺盼藍染色

臺盼藍是組織和細胞培養中常用的死細胞鑒定染色方法。正常的活細胞，胞膜結構完整，能拒染臺盼藍，使之無法進入胞內，而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，臺盼藍可進入細胞內，顯微鏡下細胞可被臺盼藍染成藍色。由圖5 A可見，對照組中Caco-2細胞未加任何處理措施，細胞活性正常，拒染臺盼藍，顯微鏡下細胞外形輪廓清晰透明，而經過白蛋白納米粒孵育并加激光照射組的Caco-2細胞（圖5 B），顯微鏡下細胞喪失了活性，且細胞膜發生了破裂，整個細胞被臺盼藍染成深藍色，表明喪失了細胞膜的完整性，Caco-2細胞已經死亡。

圖5 Caco-2細胞臺盼藍染色結果（×200）

3 討論

白蛋白具有生物可降解性、生物相容性等優良性質，可提高難溶性藥物的溶解度，避免有機高分子材料在體內的毒性，是納米載藥領域的研究熱點，被廣泛應用于抗腫瘤藥物的包載和納米粒的制備。本研究中以牛血清白蛋白為載體材料，通過去溶劑化法成功制備出包載IR780的白蛋白納米粒。此制備方法操作簡便，IR780被物理包裹于白蛋白中，與游離的IR780相比，載IR780的白蛋白納米粒可以提高IR780在水中的溶解度；制備出的白蛋白納米粒形態圓整，粒徑較小，通過激光粒度儀檢測，此白蛋白納米粒的粒徑在236 nm波長處。通過近紅外光照射后，白蛋白納米粒具有較強的光熱效應，光敏劑IR780通過光熱轉換效應可產生較強的熱量，使溶液溫度升高，增強熱療效果。

通過細胞毒性試驗發現，白蛋白納米粒可增強IR780的癌細胞的毒性作用，這可能是一方面由于白蛋白納米粒能增強細胞的藥物攝取，使IR780在細胞內大量聚集釋放，充分作用于癌細胞；另一方面，可能是因為白蛋白納米粒經過近紅外光照射后，包載的IR780通過光熱轉換效應，升高局部溫度，通過光熱效應，使腫瘤細胞溫度達到42℃，從而起到殺死腫瘤細胞的作用。

本研究中成功制備了包載IR780的白蛋白納米粒并用于腫瘤細胞的治療研究，為近紅熒光染料IR780的傳遞提供了一種新的藥物傳遞載體。此外，白蛋白納米粒通過光熱治療的作用方式為以后抗腫瘤治療提供了一種新的治療手段和方法。