姜黃素對非小細胞肺癌A549細胞增殖凋亡和侵襲能力的影響

陳永宏，高 月

（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700）

非小細胞肺癌是我國發(fā)病率和致死率最高的腫瘤性疾病，高度的侵襲性是其致死率高、復發(fā)率高的主要原因。目前，抗腫瘤藥物的作用機制大多數(shù)都是以提高腫瘤細胞凋亡率，降低腫瘤細胞增殖能力和侵襲能力為主。有研究提出，某些藥物對腫瘤細胞的上述一個特性或多個特性存在著影響作用。姜黃素是從姜黃根莖中提取出來的酚類化合物，具有抗炎、抗氧化和抑制腫瘤細胞生長的能力[1]。本研究中探討了姜黃素對腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲功能的影響機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：722n型分光光度計（上海菁華科學儀器有限公司）；acea novocyte型流式細胞分析儀（艾森生物有限公司）；奧林巴斯cx23型光學顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；genosens1850型凝膠成像儀（上海勤翔凝膠科學儀器有限公司）。

試藥：姜黃素（上海士鋒生物科技有限公司，批號B10359-25g）；二甲基亞砜（上海士鋒生物科技有限公司，批號 A5852）；小牛血清（批號 HLC1401），1640 培養(yǎng)基（批號HLC150120）均購于上海哈林生物科技有限公司。四甲基偶氮唑鹽溶液(批號M2003）；DMSO溶液(批號 D2650）；胰酶(批號 T4674）；binding buffer，Annexin-FITC，Propidum Iodide細胞凋亡檢測試劑盒(批號APOAC-1KT）均購于Sigma公司。P27單克隆抗體 (批號 P2092），Orai1 單克隆抗體(批號 O8264），Caspase-3單克隆抗體 (批號c8487），EGFR單克隆抗體(批號SAB4300352），STIM1 單克隆抗體(批號 S6197），E-cadherin單克隆抗體(批號U3254），MMP-9單克隆抗體(批號 SAB4501896），GAPDH單克隆抗體(批號G9295）均購于Sigma公司。

細胞：非小細胞肺癌A549細胞由西南醫(yī)院呼吸內(nèi)科贈送。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)方法：將對數(shù)期非小細胞肺癌A549細胞用含有7%小牛血清的1640培養(yǎng)基，按1∶5的比例在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[2]。

姜黃素溶液配置方法：將5．90 mg姜黃素用200 μL二甲基亞砜溶解，再加入7 800 μL無血清1640培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為2 000 μmol/L的姜黃素溶液原液[3]。

MTT法檢測細胞增殖情況：將細胞濃度調(diào)整為50 000個/mL后，按150mL/孔加入96孔板，在37℃及5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，吸出上清液，分別于低、中、高劑量組細胞培養(yǎng)孔中分別加入姜黃素溶液(姜黃素質(zhì)量濃度分別為 10，20，40 μmol/L）和培養(yǎng)基，調(diào)整各孔體積為150 μL，對照組則只加入等體積的培養(yǎng)基。在上述環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培養(yǎng)4 h，吸出各孔上清液，加入DMSO溶液150 μL，震蕩10 min，在酶標儀上檢測各孔在490 nm波長處的吸光度。細胞生長抑制率=（對照組吸光值-實驗組吸光值）/對照組吸光值[4-5]。

流式細胞分析技術(shù)檢測細胞凋亡情況：將各組細胞濃度為4×105個/mL的細胞分別在不含姜黃素的培養(yǎng)基和姜黃素質(zhì)量濃度為10，20，40 μmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，收集細胞，爾后用胰酶消化，洗滌，然后用binding buffer細胞凋亡檢測試劑盒重懸，加入Annexin-FITC和Propidum Iodide細胞凋亡檢測試劑盒孵育0．5 h，最后使用流式細胞分析儀檢測樣本[6]。

Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實驗檢測細胞侵襲能力：將對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞分別用不含姜黃素的培養(yǎng)基和含姜黃素質(zhì)量濃度為10，20，40 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，離心重懸，調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，將用50 mg/L的 matrigel 1∶8稀釋液濕潤后的transwell小室風干，然后每個小室加入200 μL F-12培養(yǎng)基，分別加入培養(yǎng)后的細胞，調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，將小室放在24孔板上（每孔內(nèi)含F(xiàn)-12培養(yǎng)基 200 μL），在 37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng) 24 h。將 24 孔板內(nèi)加入4%多聚甲醛1 mL，再放入小室，固定20 min，然后風干，染色，在顯微鏡下觀察，計數(shù)細胞數(shù)量。侵襲抑制率 =（1-各實驗組細胞數(shù) /對照組細胞數(shù)）×100%[7]。

Western Blotting法檢測增殖凋亡相關(guān)蛋白和侵襲相關(guān)蛋白的表達情況：將對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞分別用不含姜黃素的培養(yǎng)基、含姜黃素濃度為 10，20，40 μmol/L 的培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為4×105個 /mL，放入 12孔板中，在 37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。提取細胞總蛋白，使用BCA法檢測細胞總蛋白，最后制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后分別用P27，Orai1，Caspase-3，EGFR，STIM1，E-cadherin，MMP-9，GAPDH兔抗人單克隆蛋白在37℃條件下對上述樣品進行封閉，最后按說明書加入二抗結(jié)合，洗滌，成像[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22．0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s）表示，用t檢驗。P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖凋亡情況

由表1可知，對照組細胞吸光度顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）；而增殖抑制系數(shù)和凋亡率對照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。說明姜黃素對非小細胞肺癌A549細胞增殖能力有抑制作用，同時還有誘導細胞凋亡的作用，且與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。

表1 各組細胞增殖凋亡能力檢測結(jié)果（±s）

表1 各組細胞增殖凋亡能力檢測結(jié)果（±s）

注：與對照組相比，aP<0．05；與低劑量組相比，bP<0．05；與中劑量組相比，cP<0．05。下表同。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組吸光度0．853 ±0．021 0．752 ±0．015a 0．674 ±0．014ab 0．537 ±0．011abc增殖抑制系數(shù)（%）0 11．84 ±0．98a 20．98 ±1．24ab 37．05 ±2．23abc凋亡率（%）4．17 ± 0．87 9．83 ± 0．92a 15．76 ± 1．01ab 25．87 ± 1．22abc

2.2 細胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達情況

由表2可知，P27和Caspase-3蛋白的表達量，對照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。EGFR，Orai1，STIM1蛋白表達，對照組顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）。說明姜黃素可有效影響細胞增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達，且存在劑量依賴關(guān)系。

表2 各組細胞增殖和凋亡能力相關(guān)蛋白表達情況( ± s）

表2 各組細胞增殖和凋亡能力相關(guān)蛋白表達情況( ± s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組P27/GAPDH 1．01±0．05 1．83±0．07a 3．72±0．10ab 5．56±0．11abcOrai1/GAPDH 1．04±0．02 0．92±0．03a 0．76±0．04ab 0．53±0．02abc Caspase-3/GAPDH 67．2±7．5 110．6±9．3a 154．9±10．4ab 193．7±11．2abc EGFR/GAPDH 5．79±0．10 3．75±0．93a 2．51±0．89ab 1．42±0．78abc ST1M1/GAPDH 1．02±0．09 0．84±0．05a 0．68±0．03ab 0．48±0．02abc

2.3 細胞侵襲能力及侵襲相關(guān)蛋白表達情況

由表3可知，視野細胞數(shù)和MMP-9蛋白的表達量對照組顯著高于低劑量組，低劑量組顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于高劑量組（P<0．05）；侵襲抑制率和E-cadherin表達量，對照組顯著低于低劑量組，低劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于高劑量組（P<0．05）。說明姜黃素有抑制A549細胞侵襲的作用，且存在劑量依賴關(guān)系。

表3 各組細胞侵襲能力及侵襲相關(guān)蛋白表達量檢測結(jié)果(±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組視野細胞數(shù)124．56 ±3．67 83．24 ±3．23a 67．48 ±3．01ab 40．76 ±2．01abc侵襲抑制率（%）0 33．17 ±2．43a 45．83 ±3．43ab 67．28 ±4．24abc E-cadherin/GAPDH 0．612 ± 0．026 0．723 ± 0．023a 0．806 ± 0．017ab 0．902 ± 0．018abc MMP-9/GAPDH 0．792 ±0．019 0．685 ±0．018a 0．579 ±0．013ab 0．421 ±0．011abc

3 討論

P27和EGFR是2個與細胞周期密切相關(guān)的蛋白[9]。EGFR可啟動細胞生長周期，促進細胞進行有絲分裂，與多種腫瘤細胞的增殖存在關(guān)聯(lián)[10]。非小細胞肺癌A549細胞在接受姜黃素干預后，EGFR蛋白的含量較未接受干預的對照組細胞相比下降明顯，且這種下降幅度還與姜黃素的劑量呈顯著相關(guān)性。P27是一種可抑制細胞分裂和調(diào)控細胞周期的蛋白[11]，姜黃素可有效提高腫瘤細胞內(nèi)該蛋白的表達，從而起到抑制腫瘤細胞進行有絲分裂的作用，且這種作用與姜黃素存在著顯著的劑量依賴關(guān)系。可認為姜黃素是通過降低腫瘤細胞對EGFR的表達和提高P27蛋白表達的方式來抑制腫瘤細胞增殖。

STIM1和Orai1是鈣池操縱的鈣離子通道（SOC）家族中十分重要的2種關(guān)鍵分子，其表達量的變化直接導致細胞的炎癥、凋亡和基因轉(zhuǎn)錄變化[12]。姜黃素可有效降低上述2種蛋白表達量下降，且該效應與姜黃素劑量存在相關(guān)性。Caspase-3是Caspase家族中重要的關(guān)鍵分子，是該家族誘導細胞凋亡的關(guān)鍵效應分子[13]，姜黃素可有效誘導該分子，且該作用還與姜黃素的劑量存在相關(guān)性。因此，可推測姜黃素是通過上調(diào)腫瘤細胞Caspase-3的表達，抑制STIM1和Orai1表達，從而起到誘導細胞凋亡的作用。

姜黃素可有效降低腫瘤細胞侵襲性，這種抑制作用也與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效降低MMP-9的表達量，提高E-cadherin的表達量，且這種變化也與姜黃素存在劑量依賴關(guān)系。E-cadherin是介導細胞互相黏附的跨膜蛋白，其表達下降會導致腫瘤細胞間互相黏附松散導致腫瘤轉(zhuǎn)移概率增大，姜黃素可有效上調(diào)腫瘤細胞中該蛋白的表達，加強腫瘤細胞間的黏附力，降低其侵襲性。同時，MMP-9能降解細胞外基質(zhì)，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中起到了很大作用，姜黃素可有效降低該蛋白的表達量，降低腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力[14]。認為姜黃素抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的機制就是降低腫瘤細胞對于MMP-9的表達提高腫瘤細胞對E-cadherin表達。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素可有效抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖和侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡，且與其藥物濃度存在劑量依賴關(guān)系。隨著姜黃素濃度的提高，腫瘤細胞凋亡率、侵襲抑制率和增殖抑制系數(shù)都較對照組或劑量較低的實驗組有顯著升高，這與文獻[15]報道相符。本研究中主要是在體外環(huán)境下利用A549細胞為載體研究姜黃素對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響的，但針對在人體環(huán)境下姜黃素的藥理作用的研究較少，這將是下一步研究的方向。