四氫嘧啶類化合物XD-7006的抗炎活性及其作用機制*

夏 鴻，楊 夢，黃 華，張玲華，丁文文

（荊楚理工學院醫學院，湖北 荊門 448000）

非甾體抗炎藥物臨床使用頻率僅次于抗感染藥物[1]，但現有的抗炎藥物還不能完全滿足臨床需求，故新型抗炎藥物的開發有重大意義。多取代四氫嘧啶類化合物藥理學作用廣泛，如抗人類免疫缺陷病毒（HIV）作用[2]、抗腫瘤作用[3]、鈣離子（Ca2+）拮抗作用[4]、抗微生物作用[5]、緩解疼痛作用[6]。在抗炎活性方面，多取代四氫嘧啶類化合物隨著取代位置及取代的官能團不同，藥理活性亦有差異。Cesarini等[7]發現，在體內實驗中，多取代四氫嘧啶化合物能抑制酵母多糖所誘導的小鼠腹膜炎。在體外實驗中，二環戊基雙取代四氫嘧啶類化合物具有免疫抑制和抗炎雙重活性，可提高內毒素刺激巨噬細胞中白細胞介素10（IL-10）的水平，從而發揮抗炎作用[8]。本研究中通過篩選多個四氫嘧啶類化合物，發現化合物XD-7006（1，3-二正丁基 -1，2，3，6-四氫嘧啶 -4，5-二甲酸二乙酯）有一定的抗炎活性，通過體內外相關炎癥模型和相關炎性細胞因子的研究，探討了XD-7006對動物炎癥模型和炎性細胞因子的影響及調節機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：昆明種（KM）小鼠 50 只[體質量為（20 ±2）g]，SD大鼠40只[體質量為（200±20）g]，由湖北省實驗動物中心研究所提供，實驗動物許可證號分別為SCXK（鄂）2015-0018 和 SYXK（鄂）2015-0034，等級為SPF清潔級，飼養于溫度為（24±2）℃、相對濕度為（55±10）%的環境中。

試藥：化合物XD-7006參照文獻[9]方法合成，相對分子質量為340，淡黃色油狀物，實驗時用0．5%羥甲基纖維素鈉(CMC-Na）溶液配制；二甲苯（武漢化學試劑廠，批號為20101207）；角叉菜膠（武漢信之德生物科技有限公司，批號為20150402）。RAW264．7細胞購于中國科學院。阿司匹林、噻唑藍(MTT）、細菌脂多糖（LPS，Aladdin 公司，批號分別為 H1722011，H1305018，L16594）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒、前列腺素E2酶免疫檢測試劑盒(上海碧云天公司，批號分別為20161105，20160806）；DMEM 培 養 基 、胎 牛 血 清（HyClone公司，批號為NXD0606），誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶 -2（COX-2）抗體（CST 公司，批號分別為 0013，0002）。

儀器：GENios Pro型酶標儀(瑞士 Tecan公司）；PV-200型大鼠足跖容積測量儀(四川成都泰盟科技有限公司）；1658001型電泳儀（美國 Bio-Rad公司）；Tanon 4200型全自動化學發光成像分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1．2．1 小鼠耳廓二甲苯致炎實驗[10]

取KM小鼠50只，雌雄各半，體質量為（20±2）g，隨機分為溶劑對照組(0．5%CMC-Na）、阿司匹林組（80 mg/kg）、化合物 XD-7006 組（80，40，20 mg/kg），共5組，各10只。各組小鼠按0．01 mL/g灌胃給藥，連續給藥3 d，1次/天。末次給藥1 h后，在每只小鼠右耳內外兩側均勻涂布二甲苯30 μL致炎，0．5 h后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳根部剪下左右耳，用內徑為8 mm的小鼠打孔器分別在左右耳同一部位打下耳片，稱定質量，以兩耳片質量差（mg）作為耳廓腫脹度。

1．2．2 大鼠足跖角叉菜膠致炎實驗[11]

取SD大鼠40只，雌雄各半，體質量為（200±20）g，隨機均分為5組，各8只，其余同1．2．1項下方法。于大鼠右后足踝關節上緣處標記，末次給藥1 h后，在每只大鼠右后足掌中心皮下注射2%角叉菜膠生理鹽水0．05 mL，用大鼠足跖容積測量儀分別于注射后0，1，2，3，4，5 h時測定大鼠右后足容積，每次測量3次，取平均值為足跖容積。分別以每只大鼠1～5 h右后足容積減去其0 h時右后足容積作為對應時刻該大鼠足跖腫脹度（mL）。

1．2．3 RAW264．7 細胞培養與處理[8]

將RAW264．7細胞培養于含胎牛血清(含100U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）培養液中，置適宜條件下培養，每隔2 d換液1次。待細胞生長至對數生長期時用消化液消化，置顯微鏡下觀察，發現貼壁細胞形態變圓時，終止消化。經多次反復吹打瓶壁，使其形成均勻單細胞懸液，調整細胞懸液濃度為4×105/mL，取0．5 mL加于24孔細胞培養板內，置培養箱培養12 h，之后每孔分別加入 40，20，10 μmol/L 的化合物 XD-7006 及終質量濃度為10 μg/mL的 LPS，繼續培養16 h。取上清液，檢測NO和PGE2的水平；提取細胞總蛋白，用免疫印跡(Western Blot）法檢測細胞的iNOS及COX-2蛋白表達。

1．2．4 XD-7006對RAW264．7細胞活力的影響(MTT法）[8]

調整RAW264．7細胞懸液濃度為 1×105/mL，加入96孔板內，每孔100 μL，置細胞培養箱培養12 h，之后加入不同濃度化合物XD-7006，使其終濃度為40，20，10 μmol/L，每組均設 5 復孔，繼續培養 24 h，加入MTT(5 g/L）20 μL，再培養 4 h，終止培養，吸去孔內培養液。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μL，來回輕輕振蕩使結晶物充分溶解。最后用酶標儀測量光密度值(OD570nm），計算樣品對細胞的抑制率。

1．2．5 Western Blot法檢測 iNOS 和 COX-2 蛋白的表達[12]

用磷酸緩沖液清洗細胞，加入裂解液，冰上勻漿，充分裂解后，以12 000 g(g為重力加速度）離心10 min，取上清液，用Bradford法檢測樣品濃度后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白(上樣50 μg），電泳結束后轉移至PVDF膜，室溫牛血清白蛋白封閉1 h后加入一抗(iNOS，1 ∶2 000；COX-2，1 ∶2 000；β -actin，1 ∶5 000），過夜，漂洗，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗30 min，化學發光試劑增強反應，采用上海天能全自動化學發光凝膠成像系統，結果用Image J圖像分析軟件進行分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17．0統計軟件處理，數據以均數±標準差(）表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

由表1可知，化合物XD-7006在質量濃度為80 mg/kg和40 mg/kg時能明顯抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹，平均耳廓腫脹抑制率分別為57．34%和41．26%，與陽性對照組阿司匹林抑制率接近，在一定劑量范圍內有依耐性，與溶劑對照組比較，表現出一定的抗炎作用。

表1 化合物XD-7006對二甲苯誘導小鼠耳廓腫脹的影響（ ± s，n=10）

表1 化合物XD-7006對二甲苯誘導小鼠耳廓腫脹的影響（ ± s，n=10）

注：與溶劑對照組比較，*P<0．05，△ P<0．01。

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表2 化合物XD-7006對角叉菜膠誘導大鼠足跖腫脹的抑制作用（ ± s，mL，n=8）

表2 化合物XD-7006對角叉菜膠誘導大鼠足跖腫脹的抑制作用（ ± s，mL，n=8）

注：與溶劑對照組同時刻比較，*P<0．05，△ P<0．01。

組別溶劑對照組XD-7006高劑量組XD-7006中劑量組XD-7006低劑量組阿司匹林組劑量(mg/kg）-80 40 20 80 1 h 0．22 ± 0．09 0．14 ± 0．08 0．16 ± 0．09 0．18 ± 0．08 0．12 ± 0．08*2 h 0．36 ±0．08 0．19 ±0．09△0．21 ±0．09△0．28 ±0．10 0．24 ±0．10△3 h 0．38 ± 0．10 0．19 ± 0．10△0．24 ± 0．08△0．30 ± 0．11*0．24 ± 0．09△4 h 0．36 ± 0．09 0．17 ± 0．08△0．22 ± 0．08△0．27 ± 0．09*0．23 ± 0．09△5 h 0．34 ±0．08 0．15 ±0．06△0．21 ±0．10*0．24 ±0．09*0．20 ±0．09*

2.2 對角叉菜膠誘發的大鼠足跖腫脹的影響

由表2可知，大鼠足跖腫脹實驗中，化合物XD-7006 高、中、低劑量組（80，40，20 mg/kg）中，給藥 3 ～5 h后與溶劑對照組相比，差異均有統計學意義，顯示出一定的劑量依耐性。

2.3 對RAW264.7細胞代謝活力的影響

MTT法檢測結果見表3。可見，在給藥濃度10～80 μmol/L內，對RAW264．7細胞活力都有不同程度的抑制作用，但在本實驗的給藥濃度范圍內（10～40μmol/L）對其代謝活力無明顯影響（P>0．05）。因此，本實驗選取的最大給藥劑量40 μmol/L對RAW264．7細胞安全。

表3 化合物XD-7006對RAW264．7細胞代謝活力的影響（n=5）

2.4 對LPS誘導RAW264.7細胞分泌一氧化氮的影響

由表4可見，與全培對照組相比較，各給藥組和阿司匹林組加入 LPS(10 μg/mL）后，RAW264．7 細胞分泌的一氧化氮含量明顯增加（P<0．05），說明造模成功。化合物XD-7006在10～40 μmol/L濃度范圍內，可不同程度地抑制LPS誘導的一氧化氮的產生，與LPS組比較，給藥組差異有統計學意義（P<0．05），給藥組抑制率均高于陽性對照阿司匹林組500 μmol/L。

表4 化合物XD-7006對LPS刺激RAW264．7細胞產生NO的抑制作用( ± s，n=3）

表4 化合物XD-7006對LPS刺激RAW264．7細胞產生NO的抑制作用( ± s，n=3）

注：與 LPS 組比較，*P<0．05，△P<0．01。

組別全培對照組LPS組XD-7006高劑量組XD-7006中劑量組XD-7006低劑量組阿司匹林組濃度（μmol/L）-10 40 20 10 500 NO(μmol/L）10．25 ±4．58△41．57 ±7．56 14．64 ±6．35△18．49 ±5．36△27．06 ±7．32*28．54 ±7．15*抑制率(%）--64．78 55．52 34．90 31．34

2.5 對RAW264.7細胞產生PGE2的影響

由表5可知，在LPS質量濃度為10 μg/mL時能顯著誘導RAW264．7細胞分泌PGE2，與全培對照組比較，差異有統計學意義（P<0．05）。化合物XD-7006濃度為 40，20，10 μmol/L 和 阿 司 匹 林 （500 μmol/L）對RAW264．7細胞產生PGE2都有不同程度的抑制，與LPS 比較，差異有統計學意義（P<0．05）。

表5 XD-7006對LPS刺激RAW264．7細胞產生PGE2的抑制作用( ± s，n=3）

表5 XD-7006對LPS刺激RAW264．7細胞產生PGE2的抑制作用( ± s，n=3）

注：與 LPS 組比較，*P<0．05，△P<0．01。

抑制率(%）組別全培對照組LPS組XD-7006高劑量組XD-7006中劑量組XD-7006低劑量組阿司匹林組濃度（μmol/L）-10 40 20 10 500 PGE2(pg/mL）2 257±186△7 824±920 2 971±352△3 581±426△5 147±695*2 834±335△--62．03 54．23 34．22 63．67

2.6 對RAW264.7細胞中iNOS和COX-2蛋白表達的影響

由圖1可見，與LPS組相比，化合物XD-7006濃度為10，20，40 μmol/L能降低iNOS蛋白表達水平，抑制率差異有統計學意義（P<0．05）。另外，本實驗還檢測了XD-7006對COX-2蛋白表達的作用，在20 μmol/L和40 μmol/L給藥濃度下顯著降低COX-2蛋白表達水平，差異有統計學意義（P<0．05）。

圖1 XD-7006對LPS誘導RAW 264．7細胞中iNOS和COX-2蛋白表達的作用

3 討論

非甾體抗炎藥廣泛應用于關節炎、風濕性疾病及其他原因造成的疼痛發熱癥狀，但長期使用或使用不當，會造成消化道損傷、肝腎毒性、心血管損傷等不良反應[13]。糖皮質激素是甾體類抗炎藥，抗炎作用雖強大，但因其有諸多嚴重的不良反應，限制了其臨床應用。

四氫嘧啶類衍生物作為抗炎藥物，處于基礎研究階段尚未應用于臨床。本研究中將前期開發的ZL-5015（1，3- 二環戊基 -1，2，3，6-四氫嘧啶 -4，5-二甲酸二乙酯）二環戊基用正丁基取代合成化合物XD-7006，在整體和細胞水平上進行抗炎活性研究，在四氫嘧啶的1，3位用脂肪烴代替烷烴或芳香烴，抗炎活性進一步增強。

動物實驗表明，化合物XD-7006能抑制急性炎癥的產生。在二甲苯所致耳廓腫脹模型中，其給藥質量濃度為80 mg/kg時耳廓腫脹抑制率達57．34%，優于同等劑量下阿司匹林的抗炎作用（52．44%）。在角叉菜膠誘導的足趾腫脹模型中，測量給藥3 h時大鼠足趾達最大腫脹度，化合物XD-7006在高（80 mg/kg）、中（40 mg/kg）、低（20 mg/kg）劑量組對不同時刻大鼠足趾腫脹均有不同程度的抑制作用，進一步提示化合物XD-7006在整體水平上具有一定的抗炎活性。

在炎癥刺激下，iNOS能產生大量的NO，說明NO是炎性反應的重要因子[14]。PGE2是炎癥和炎癥相關疾病的重要介質，環氧酶是將脂肪酸轉化為前列腺素（PGs）的關鍵酶，當炎癥或缺氧不斷刺激機體后，COX-2將會表達增多[15]。化合物XD-7006抗炎活性的體外實驗表明，其可抑制脂多糖LPS誘導的RAW264．7細胞NO和PGE2的產生。本研究結果顯示，化合物XD-7006對2種蛋白表達有不同程度的抑制作用，但相比而言對COX-2蛋白表達的抑制更明顯。提示化合物XD-7006抗炎活性的機制與PGE2產生關系更密切。本研究中通過體內外實驗初步探討化合物XD-7006抗炎活性，同傳統的經典非甾體抗炎藥阿司匹林在抑制急性炎癥模型上還存在差距，說明其抗炎作用還不夠理想。

綜上所述，化合物XD-7006顯示出非甾體抗炎藥的特點，如開發應用于臨床，可考慮用于急性損傷導致的炎癥。另一思路是通過該研究可獲得與抗炎活性有關的新的構效關系信息，并可在此結構上，通過系列改造有望得到療效更好、毒副作用更少的新型非甾體藥物。