激活葡萄糖腦苷脂酶對(duì)不同H_Y分期的帕金森病患者皮膚成纖維細(xì)胞自噬活性的影響

陳 敏，陳艷紅，張小喬

近年來多項(xiàng)研究提示蛋白質(zhì)的異常聚集或者功能異常的細(xì)胞器降解減少都是帕金森病(parkinsons disease，PD)的致病原因［1］，自噬 － 溶酶體途徑(autophagy_lysosome pathway，ALP)是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要方式，特別是在異常聚集蛋白的清除中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)對(duì)蛋白的降解需要葡萄糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase GBA)的正常活性［2］。在前期試驗(yàn)提示激活GBA可以強(qiáng)化PD患者皮膚自噬水平［3］，本文進(jìn)一步探討激活GBA對(duì)于不同H_Y分期的PD患者皮膚成纖維細(xì)胞自噬的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料:選擇2014年9月至2017年4月在我院就診的PD患者36例，其中男19例，女17例，年齡49～18歲，平均(59.39±7.23)歲，其診斷均符合原發(fā)性PD的標(biāo)準(zhǔn)［4］。經(jīng)過同一位神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生間斷評(píng)估3次，排除藥物、腦血管病等帕金森綜合征。根據(jù)臨床癥狀嚴(yán)重度的不同［5］，將帕金森病的患者按病程分為早期(hoehn_Yahr分期1～2.5級(jí))和中晚期(hoehn_Yahr分期3～5級(jí))，見表1。

表1 帕金森病患者的一般情況(例)

1.2 方法:本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入患者簽署知情同意書，上臂背側(cè)肘關(guān)節(jié)皮膚常規(guī)消毒，選擇皮下肌肉較豐富的區(qū)域局部麻醉后微型取皮器產(chǎn)取皮，皮膚分裝至EP管，－20°保存?zhèn)溆谩＿\(yùn)用Western印跡雜交分析蛋白表達(dá)的量，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜－封閉－一抗－二抗－洗膜ECL光化學(xué)法顯色－曝光，內(nèi)參為GAPDH。酶標(biāo)儀(Bio_Rad，美國)自動(dòng)測量并記錄平均吸光度值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:通過SPSS 16.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料兩組間用率比較，比較采取χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用(±s)表示，兩組間比較用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PD患者皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)源性Beclin 1、LC3_II/LC3_l的表達(dá):兩組患者 Beclin 1、LC3_II/LC3_l的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 早期與中晚期血漿Beclin 1及LC3_II/LC3_l濃度比較(x－ ± s)

2.2 相關(guān)分析:LC_3是一種非常經(jīng)典的自噬體標(biāo)記物。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC_3，即18KD的LC_3I和16KD的LC_3II。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)合成LC_3后，會(huì)在催化作用下發(fā)生一系列泛素樣反應(yīng)，自噬激活時(shí)，LC_3I被活化偶聯(lián)生成LC_3II。因此，LC_3II的量與自噬小體的形成密切相關(guān)，而LC_3II與LC_3I的比值是反應(yīng)自噬活性的可靠指標(biāo)［6］。因此本實(shí)驗(yàn)直接觀察指標(biāo)為LC_3II與LC_3I的比值反映自噬活性水平，本結(jié)果可見中晚期PD患者的Beclin_1的水平及LC3_II/LC3_I比值明顯高于早期PD患者，提示中晚期PD患者皮膚成纖維細(xì)胞自噬活性較早期PD患者明顯增強(qiáng)，中晚期患者共核蛋白的突變會(huì)破壞α_螺旋的結(jié)構(gòu)，使其形成β折疊，則產(chǎn)生神經(jīng)毒性寡聚體的聚集，而錯(cuò)誤折疊及細(xì)胞器的異常集聚，誘導(dǎo)自噬的出現(xiàn)。

3 討論

老年P(guān)D患者存在認(rèn)知功能障礙，其簡易智力檢查(MMSE)評(píng)分與H_Y分期呈負(fù)相關(guān)［7］，PD患者外周血CD14 mRNA表達(dá)與其H_Y分期正相關(guān)［8］。由此可見PD患者不同H_Y分期除了臨床癥狀的差異，還有認(rèn)知、免疫指標(biāo)、分子水平的差異，因此本研究依據(jù)H_Y分期進(jìn)行分組。

有多項(xiàng)研究表明自噬與PD關(guān)系密切，自噬的強(qiáng)弱對(duì)PD的病情進(jìn)展有直接的影響，國外有研究提示皮膚成纖維細(xì)胞的病變與中腦黑質(zhì)紋狀體有一致性，在正常狀態(tài)下，即沒有異常的蛋白質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，抑制神經(jīng)元內(nèi)的自噬也會(huì)使神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤積聚的蛋白聚集體，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)變性的發(fā)生［9］。所以推測，如果通過藥物對(duì)活性位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控從而提高自噬的活性，可能會(huì)對(duì)聚集體的積聚產(chǎn)生一定的阻礙作用，進(jìn)而能夠使有關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)的時(shí)間延遲。雷帕霉素屬于親脂性的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，是一種非常經(jīng)典的誘導(dǎo)自噬的藥物，目前腫瘤、代謝及血管疾病等研究運(yùn)用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬的作用開展一系列研究，針對(duì)神經(jīng)疾病的研究還限于果蠅、小鼠等模型，自噬的特點(diǎn)是它對(duì)多種信號(hào)轉(zhuǎn)化來的刺激高度敏感，在所有真核細(xì)胞中調(diào)控自噬的信號(hào)途徑非常復(fù)雜，酶學(xué)占據(jù)著自噬相關(guān)信號(hào)的特權(quán)地位，GBA是自噬過程中的生物酶之一，在酵母中，下游的激酶控制著自噬小體的形成［10］。作為自噬調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵位點(diǎn)，一方面可以通過下游因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯來抑制自噬;另一方面，可以直接作用于自噬相關(guān)蛋白，影響自噬體形成。本研究通過雷帕霉素激活GBA活性，在此基礎(chǔ)上探討不同H_Y分期的PD患者表皮成纖維細(xì)胞的自噬活性的差異。

自噬的生物標(biāo)志物有各種蛋白，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC_3)是目前經(jīng)典的標(biāo)記物之一［11］，而LC_3II/LC_3I的比值是自噬活性強(qiáng)弱的判斷指標(biāo)［12］。LC3是在高等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種自噬膜蛋白，本研究中運(yùn)用此指標(biāo)判斷PD患者表皮細(xì)胞自噬活性。研究結(jié)果表明兩組患者Beclin 1、LC3_II/LC3_l的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中晚期PD患者的Beclin_1的水平和LC3_II/LC3_I比值明顯高于早期PD患者。提示中晚期PD患者皮膚成纖維細(xì)胞自噬活性較早期PD患者明顯增強(qiáng)，自噬可能與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，這也提示中晚期PD患者表皮細(xì)胞有較多的錯(cuò)誤折疊及細(xì)胞器的異常集聚，需要較強(qiáng)的自噬來降解異常蛋白質(zhì)，GBA激活劑雷帕霉素與這些需要清除的異常物質(zhì)共同作用，啟動(dòng)了強(qiáng)烈的自噬活性。

自噬功能失調(diào)在包括PD的神經(jīng)變性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。因此，闡明PD患者體內(nèi)的自噬功能以及葡萄糖腦苷脂酶對(duì)PD患者外周細(xì)胞自噬功能的影響，將有助于明確本病的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步探究帕金森病的防治提供了理論依據(jù)，本研究表明，中晚期PD患者皮膚自噬活性較早期PD患者明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量將有利于增加結(jié)論的可靠性并闡明具體機(jī)制。