洋蔥表皮細胞染色方法的優化

陳文榮 胡盈盈 沈芷琦 陳秉初

(浙江師范大學化學與生命科學學院 金華 321004)

洋蔥鱗片葉表皮細胞實驗是生物學教學的基礎實驗。在實驗教學中，學生能觀察到細胞核、細胞質、細胞壁和細胞膜等簡單細胞結構。經典的染色劑為I2-KI試劑，其基本原理為I2與蛋白質發生顯色，細胞質內的蛋白質濃度較細胞核內的低，細胞質顯淺棕黃色，細胞核顯深棕黃色。在教學實踐中，碘染色所需時間過長，染色效果單一，觀察效果不佳。有人嘗試使用Feulgen染色法[1]、甲基綠-派洛寧染色法[2]、中性紅染色[3]、孔雀綠染色、ZnO作用等較為創新的染色方法將洋蔥鱗片葉表皮細胞染色，但實驗步驟較為繁瑣，不適合于中學實驗教學。本文以洋蔥鱗片葉表皮為材料，從有機試劑(如堿性品紅、亞甲基藍、固綠、蘇木精等)和無機染料[如24.5%H2SO4、飽和Fe2(SO4)3溶液、飽和CuSO4溶液、0.5mol/L Li2SO4溶液等]進行單染色和交互染色，以尋求更好的染色效果，豐富植物細胞染色色系，并為中學實驗教學提供更多的染色方法選擇及更為豐富的染色效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 放置7d左右的洋蔥。試劑： 堿性品紅、固綠、亞甲基藍、苯胺藍、核固紅、蘇木精、次甲基藍、98% H2SO4、Fe2(SO4)3、CuSO4、Li2SO4、碘液、酒精、蒸餾水。

1.2 試劑配制 本研究相關試劑配制方法如下：

試 劑配置方法核固紅染色液稱取0.500g固綠溶于50mL 95%酒精苯胺藍染色液稱取0.050g苯胺藍和1.000g K2HPO4溶于50mL蒸餾水亞甲基藍染色液稱取0.830g亞甲基藍溶于50mL蒸餾水(水溫為35℃～40℃),直至完全溶解,再冷卻至20℃固綠染色液稱取0.500g固綠溶于50mL 95%酒精蘇木精染色液稱取0.500g蘇木精溶于50mL無水酒精,讓其氧化成熟4周次甲基藍染色液稱取0.050g次甲基藍溶于50mL 50%酒精堿性品紅染色液稱取0.750g堿性品紅溶解于50mL 70%酒精24.5% H2SO4溶液取98% H2SO4 10mL稀釋3倍飽和Fe2(SO4)3溶液取過量的Fe2(SO4)3溶于50mL的蒸餾水中,溶解至飽和,過濾飽和CuSO4溶液取過量的CuSO4溶于50mL的蒸餾水中,溶解至飽和,過濾0.5mol/L Li2SO4溶液碘液稱取5.5g Li2SO4溶于少量的蒸餾水中,定容至50mL稱取1.1g I2和2.2g KI溶于少量蒸餾水中,定容至50mL

1.3 實驗步驟 ①取材： 用鑷子取適量洋蔥的外(內)表皮，置于載玻片上；②醇洗[4]： 將撕取的洋蔥表皮置于75%酒精中浸泡1min；③水洗： 用緩慢的蒸餾流水洗滌；④染色： 滴加相應的染色劑，進行染色；⑤水洗： 用緩慢的蒸餾流水沖洗，充分洗去浮色，直至所流下的水為無色；⑥蓋片觀察： 蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.4 染色方法 具體步驟如下：

(1) 有機試劑單染色 核固紅、亞甲基藍、固綠、次甲基藍進行染色，染色時長為10min；使用苯胺藍進行染色時，染色時長為15min；使用蘇木精進行染色時，染色時長為5min；使用堿性品紅染色時，染色時長為1min。

(2) 無機試劑單染色 使用24.5% H2SO4溶液、飽和Fe2(SO4)3溶液染色、飽和CuSO4溶液染色、0.5mol/L Li2SO4溶液進行染色時，染色時長均為10min。

(3) 交互染色 12.25% H2SO4+亞甲基藍、24.5% H2SO4+核固紅、24.5% H2SO4+亞甲基藍、24.5% H2SO4染色+固綠及碘液+24.5% H2SO4各組別中，前后兩種染色劑均染色7～10min；6.225% H2SO+碘液中，前后兩種染色劑均染色5min；碘液+固綠中，前者染色5min，后者染色25min；固綠+碘液，前者染色10min，后者染色5min；苯胺藍+核固紅、核固紅+苯胺藍、苯胺藍+固綠、核固紅+固綠、固綠+亞甲基藍和亞甲基藍染+碘液各組別中，前后兩種染色劑均染色7min；固綠與亞甲基藍的混合液、品紅與亞甲基藍的混合液和固綠與堿性品紅的混合液，均染色7～10min。

2 研究結果

2.1 有機染料單染色 有機染料染色效果中，次甲基藍與堿性品紅的染色效果最好，染色清晰，大部分細胞著色均一。蘇木精與核固紅的染色效果次之，蘇木精的染色效果與碘液類似，細胞核呈棕黃色，細胞質呈黃色，但在染色時間上有所減少；核固紅染色較為清晰，相對傳統的碘液染色，染色色系上有所突破，但多數細胞著色深淺不一，觀察發現可能是由于核固紅染液中的雜質所致。苯胺藍、亞甲基藍、固綠的染色效果不佳，對細胞質的染色效果顯著，而細胞核未見染色，觀察效果不佳(染色效果圖請掃文后二維碼)。

2.2 無機染料單染色 24.5% H2SO4溶液與飽和Fe2(SO4)3溶液染色效果最好，染色清晰，細胞質、細胞核區分明顯，但是細胞著色不均一，部分細胞未被染色。0.5mol/L Li2SO4溶液染色效果次之，細胞核呈綠色，細胞質呈淺綠色，但細胞質呈現顆粒狀，影響觀察。飽和CuSO4溶液染色效果不佳，對細胞質的染色效果顯著，呈黃色，且大部分細胞著色，但未對細胞核有染色效應(染色效果圖請掃文后二維碼)。

2.3 染色劑交互染色 相應染色效果如下：

2.3.1 硫酸與其他染色液交互染色 硫酸與染色劑的配合使用導致細胞發生質壁分離，從而使細胞膜與細胞壁的界線更為清晰。相較而言，12.25% H2SO4+亞甲基藍、24.5% H2SO4+亞甲基藍、24.5% H2SO4+核固紅、24.5% H2SO4+固綠的染色效果最好，染色清晰，大部分細胞著色均一，質核區分顯著，細胞核比細胞質的顏色深，細胞發生質壁分離，可以更好地區分細胞壁與細胞質。6.225% H2SO4+碘液、碘液+24.5% H2SO4的染色效果一般，大部分細胞著色，細胞質、細胞核可以區分，但是有黑色雜質影響觀察(染色效果圖請掃文后二維碼)。

2.3.2 有機染料交互染色 有機染料的交互染色，不僅改變染色色系，同時也能改進染色劑的著色。相較而言，品紅與亞甲基藍混合液的染色效果最好，細胞核呈深紫色，細胞質呈紫色，染色鮮艷清晰，細胞著色均一，質核區分顯著，且內外表皮細胞染色效果均顯著。苯胺藍+核固紅、固綠+碘液、固綠+亞甲基藍、固綠與亞甲基藍混合液、亞甲基藍+固綠的染色效果次之，染色較為清晰，大部分細胞著色，細胞質、細胞核明顯區分。固綠+碘液和固綠與亞甲基藍混合液染色后的細胞的細胞質與細胞核顏色呈不同色系，效果類似于甲基綠-派洛寧染色法[2]。苯胺藍+固綠、核固紅+固綠的染色效果一般，大部分細胞著色，細胞質、細胞核可以區分，但是有雜質影響觀察。核固紅+固綠、苯胺藍+固綠染色后的細胞的細胞壁呈綠色[4]，有助于觀察。亞甲基藍+碘液、堿性品紅與固綠混合液的染色效果最差，大部分細胞著色，前者細胞核染色效果不明顯，后者細胞結構破壞(染色效果圖請掃文后二維碼)。

在交互染色實驗中，染色劑的書寫順序即為添加順序。若無特殊交代染色劑的劑量比，劑量比均為1 ∶1；若無特殊交代實驗材料，實驗材料均為洋蔥鱗片葉外表皮。

3 討論

無機染色劑中配以24.5% H2SO4溶液導致細胞發生質壁分離，從而使細胞膜與細胞壁的界線更為清晰，且相較于傳統的碘染色，顏色更為鮮艷(見硫酸與其他染色劑交互實驗染色效果圖)；同時，24.5% H2SO4溶液的加入使染色時間顯著縮短，其染色機理可能是洋蔥表皮細胞內某種物質具有類似于酸堿指示劑的作用；也可能是由于H2SO4作為強酸，使蛋白質變性所致，但系列濃度的HCl、H3PO4等強酸、中強酸的染色實驗并未觀察到上述染色效果(研究結果本文未包含)。因此，H2SO4溶液的染色原理仍需進一步研究探討。為獲得更好的染色效果，本研究同時進行了H2SO4的濃度梯度染色研究，發現98%、49%的H2SO4會嚴重破壞細胞結構，細胞呈“解體”狀；而12.25% H2SO4無染色現象(相關結果本文未包含)。

染色時間會影響染色效果： 時間過長，原染色為橙色的細胞會變成綠色，這可能是由于顯色產物結構不穩定，被空氣氧化或者進一步與胞內其他物質反應所致。而無機試劑中的飽和Fe2(SO4)3溶液和飽和CuSO4溶液能使細胞著色，其染色機理可能是有色金屬鹽使蛋白質變性并產生有色絡合物(見硫酸與其他染色劑交互實驗染色效果圖)。但由于金屬離子進入表皮細胞不均衡，因此染色效果差于有機染料，但是在染色劑的種類上有所突破，有利于擴大細胞染色劑的選擇范圍。在各類常見的有機染色劑染色發現，堿性品紅染色效應極強，染色速度也最快，只需染色1min即可觀察；且在交互實驗中，絕大部分與堿性品紅組合的實驗，另一種染色劑的效果會被完全地掩蓋(見有機染色劑交互染色效果圖)。這可能是由于在近中性范圍內堿性品紅與DNA有較強的結合[4]。

染色劑組合染色往往能改進染色效果，但部分染色組合是染色劑組分獨立染色結果，酸性染料使細胞質著色、堿性染料使細胞核著色[5]。而快速細胞染色劑FME也是根據酸性、堿性染料的共同作用使細胞各結構染色。同時，各染色劑的劑量比會顯著影響染色效果，在甲基綠—派洛寧染色法較好的配比為3 ∶2和1 ∶1[2]；而堿性品紅與亞甲基藍混合液染色效果最好的配比是1 ∶1，當配比為1 ∶4和1 ∶6會出現類似色素帶問題。另外，單染色時對細胞核染色效果不明顯的染色劑與24.5%H2SO4溶液共同作用時，對細胞核的染色效果明顯增強(見有機染料單染色效果圖和硫酸與其他染色劑交互染色效果圖)，這可能是由于H2SO4中的H+使細胞核膜失去選擇透性，染色劑分子進入細胞核，使細胞核染色。

4 小結

根據研究結果，值得借鑒參考的有： ①紅色色系中，堿性品紅單染色和24.5% H2SO4+核固紅的染色效應好；②黃色色系中，24.5% H2SO4溶液的染色見效快，且獲取試劑方便；③綠色色系中，飽和Fe2(SO4)3溶液和24.5% H2SO4+固綠的染色效果佳；④藍色色系中，次甲基藍、12.25% H2SO4+亞甲基藍和苯胺藍+核固紅的染色效果好。

(*通信作者)