陳 萍,劉 璐,李曉東*,曲秀偉,王海霞,張秀秀
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)
近年來(lái),高血壓、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)病率逐年升高,其原因是攝入較多的脂肪及體內(nèi)存在過(guò)多的自由基[1]。過(guò)多的自由基會(huì)導(dǎo)致膜脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷[2]。食源性天然抗氧化物質(zhì)與人工合成抗氧化物質(zhì)相比,具有安全、易消化、營(yíng)養(yǎng)功能等特點(diǎn)。
契達(dá)干酪是世界上消費(fèi)最多的一種干酪,在干酪成熟過(guò)程中伴隨著一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),產(chǎn)生了多種生物活性物質(zhì),使其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。乳源性抗氧化物質(zhì)具有阻止自由基生成、清除已形成自由基和活性氧的功能,從而防止這些物質(zhì)對(duì)機(jī)體大分子的損傷[4]。牛乳發(fā)酵可以進(jìn)一步促進(jìn)酪蛋白中抗氧化物質(zhì)的釋放,發(fā)酵產(chǎn)生的酪蛋白衍生物可清除自由基和提高人類(lèi)淋巴細(xì)胞過(guò)氧化氫酶活性和谷胱甘肽水平,這使干酪的抗氧化活性遠(yuǎn)高于液態(tài)乳[5]。益生菌作為一種微生物,除了能將周?chē)承┨囟ㄎ镔|(zhì)分解成可利用的小分子物質(zhì),自身還有很多益生功能[6]。Zhang Yong等[7]研究了40株益生菌,證明這些菌株都有一定的抗氧化能力,能夠有效清除氧自由基。Abadía-García等[8]將干酪乳桿菌加入到農(nóng)家干酪中,發(fā)現(xiàn)益生菌能提高農(nóng)家干酪的抗氧化性。
目前,關(guān)于干酪抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的原因眾說(shuō)紛紜。Meira等[9]提取鑒定了巴西牛乳干酪中的生物活性物質(zhì),證實(shí)其來(lái)源于αs1-酪蛋白。Timón等[10]研究了不同凝乳酶對(duì)Burgo干酪提取物自由基清除能力的影響,結(jié)果表明植物源凝乳酶干酪具有最高的抗氧化能力。馬玲等[11]認(rèn)為干酪的抗氧化性與發(fā)酵菌種有關(guān),其結(jié)果表明干酪提取液的抗氧化效果隨菌種、成熟時(shí)間的不同而不同。Abadía-García等[8]又猜測(cè)益生菌干酪中的生物活性物質(zhì)與干酪中的活菌數(shù)有關(guān)。
因此,本實(shí)驗(yàn)在保證菌株的耐酸、耐鹽性良好,適用于干酪生產(chǎn)的前提下,以水解性和抗氧化活性為指標(biāo),篩選出水解能力較強(qiáng)和抗氧化能力較強(qiáng)的益生菌,將其分別添加到契達(dá)干酪中,比較分析干酪在成熟過(guò)程中活菌數(shù)和抗氧化活性的變化,探究益生菌自身的抗氧化能力和水解能力對(duì)干酪抗氧化性的影響。
瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)1.0612、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)1.0911、L. rhamnosus 1.0385、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)1.0320、L. rhamnosus 1.0205、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)1.0357、L. helveticus 1.0618、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus casei)1.0407、雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)07-300B 9 株菌是從乳中或健康的成人腸道中分離得到,經(jīng)16S rDNA技術(shù)和序列分析比對(duì)鑒定,屬于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會(huì)規(guī)定的益生菌的菌種,并對(duì)分離后的9 株菌進(jìn)行活性測(cè)定,證實(shí)其具有益生功能,現(xiàn)保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。
商業(yè)發(fā)酵菌種Lactococcus lactis subsp. cremoris和Lactococcus lactis subsp. lactis混合菌種、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司;生牛乳 哈爾濱市香坊農(nóng)場(chǎng)完達(dá)山奶源基地;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司;鐵氰化鉀、硫酸亞鐵 天津博迪化工股份有限公司;三氯化鐵 天津市巴斯夫化工有限公司;1,10-鄰二氮菲 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;雙氧水 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。
JD500-2電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;VD-1320超凈工作臺(tái) 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司;SYQDSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司;數(shù)顯恒溫水浴箱 上海比朗儀器有限公司;3k15離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;UT-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。
1.3.1 菌株的活化與保存
MRS培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min,接種實(shí)驗(yàn)菌株后37 ℃培養(yǎng)24 h,傳代至活菌數(shù)為1.0×109CFU/mL,將菌液與50%滅菌甘油1∶1混合,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩T賹⒁嫔大w積分?jǐn)?shù)2%接種到60 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%脫脂乳和MRS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至活菌數(shù)為1.0×109CFU/mL。
1.3.2 益生菌初篩
1.3.2.1 益生菌耐酸能力測(cè)定
20 mL活化后的菌懸液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min,沉淀用pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌,調(diào)整菌體濃度為1.0×109CFU/mL,加入20 mL滅菌的pH 3.0鹽酸,37 ℃水浴4 h,每隔1 h取樣做活菌計(jì)數(shù)。
1.3.2.2 耐鹽能力測(cè)定
向MRS培養(yǎng)基中添加NaCl,質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8 g/100 mL,121 ℃滅菌30 min后,按2%接種益生菌,37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A),并按式(1)計(jì)算其存活率:

1.3.2.3 蛋白水解能力測(cè)定
采用鄰苯二甲醛法對(duì)蛋白水解能力進(jìn)行測(cè)定[12],以L-亮氨酸計(jì)(mmol/L)。
1.3.2.4 抗氧化能力測(cè)定
益生菌細(xì)胞懸浮液制備:菌液在4 ℃、8 000×g離心20 min獲得菌體沉淀,用滅菌的磷酸緩沖溶液(pH 7.2)洗滌后,重懸于磷酸鹽緩沖液中并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×109CFU/mL,為完整細(xì)胞懸液[13]。
菌株DPPH自由基清除率測(cè)定參照Arasu等[14]方法。測(cè)定各組吸光度(A),DPPH與磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)混合作為空白,按式(2)計(jì)算益生菌DPPH自由基清除率:

羥自由基清除率參照Wong等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。用去離子水替代菌懸液,表示為A空白,將H2O2換成同體積的去離子水,以同樣條件培養(yǎng)并檢測(cè),為A對(duì)照,按照式(3)計(jì)算益生菌羥自由基清除率:

還原能力測(cè)定參照王曦等[16]的方法。
1.3.3 益生菌契達(dá)干酪的制作
原料乳→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏殺菌(63 ℃,30 min)→冷卻(32℃)→添加發(fā)酵劑和益生菌→發(fā)酵(32 ℃,60 min)→添加CaCl2和凝乳酶→凝乳(32 ℃,90 min)→切割(1 cm3)→攪拌升溫至42 ℃(每3~5 min升高1 ℃)→保溫?cái)嚢瑁?0 min)→靜置(30 min)→排乳清→凝塊堆砌(每15 min反轉(zhuǎn)堆積一次,反轉(zhuǎn)7 次)→破碎與加鹽→成型壓榨→包裝、8 ℃成熟
Batch-1:發(fā)酵劑添加量為0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同);Batch-2:發(fā)酵劑添加量為0.005%,抗氧化活性較好的益生菌添加量為1.2%;Batch-3:發(fā)酵劑添加量為0.005%,水解能力較好的益生菌添加量為1.2%。
1.3.4 契達(dá)干酪成分分析
總蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》;脂肪測(cè)定參照GB 5413.3—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測(cè)定》;水分測(cè)定參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》;氯化鈉測(cè)定參照GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測(cè)定》;pH值測(cè)定:干酪與去離子水在無(wú)菌條件下以1∶2比例均勻混合,用pH計(jì)直接測(cè)定。
1.3.5 契達(dá)干酪活菌數(shù)的測(cè)定
將10 g干酪溶于90 mL蛋白胨水中,20 000 r/min勻漿1 min,稀釋后平板計(jì)數(shù)。
1.3.6 益生菌契達(dá)干酪抗氧化活性分析
根據(jù)Gómez-Ruiz等[17]的方法制備干酪水溶性提取物。50 mg凍干樣品溶于1 mL去離子水用于DPPH自由基和羥自由基清除能力分析,15 mg樣品溶于1 mL去離子水用于還原能力測(cè)定。
DPPH自由基清除能力的測(cè)定:0.1 mL(50 mg/mL)水溶性提取物與3.9 mL新制備的60 μmol/L DPPH-甲醇溶液混合,室溫避光45 min后用在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,并用去離子水代替樣品作空白[18]。羥自由基清除能力的測(cè)定:根據(jù)Liu Jun等[19]的方法。還原能力的測(cè)定:根據(jù)Duh等[20]的方法。
1.3.7 質(zhì)構(gòu)分析
參照Liu等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定。
1.3.8 感官評(píng)價(jià)
根據(jù)Ahmed等[22]的方法進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 契達(dá)干酪感官評(píng)價(jià)細(xì)則Table 1 Criteria for sensory evaluation of Cheddar cheese
2.1.1 益生菌耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果
酸是益生菌最大的脅迫之一,在干酪制作過(guò)程中,益生菌要克服低pH值環(huán)境,同時(shí)也要保證菌株在胃液中的存活率。耐酸能力的強(qiáng)弱可直接影響益生菌最終的成活率和功效,因此耐酸能力是評(píng)價(jià)益生菌的關(guān)鍵指標(biāo)之一。益生菌在酸性環(huán)境下的存活率如表2所示,9 株益生菌均有一定的耐酸能力,當(dāng)作用1 h 后,L. casei 1.0407、L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的存活率在50%以上,作用4 h 后,這3 株均的存活率仍在10%以上。

表2 益生菌在pH 3.0的稀鹽酸中作用不同時(shí)間后的存活率Table 2 Survival rates of probiotics in HCl (pH 3.0) at different time points
2.1.2 益生菌耐鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果
契達(dá)干酪的含鹽度較高,對(duì)益生菌的生長(zhǎng)存在抑制作用。篩選出耐鹽益生菌性好的菌株對(duì)其在干酪中的存活率起關(guān)鍵作用。益生菌在不同NaCl質(zhì)量濃度MRS培養(yǎng)基中的存活率如表3所示,當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為2 g/100 mL時(shí),除L. helveticus 1.0618外,其他菌株存活率均在90%以上,且無(wú)顯著差異。NaCl質(zhì)量濃度為8 g/100 mL時(shí),B. bifidum 07-300B的存活率最高,L. acidophilus 1.0357、L. casei 1.0407、L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911這4 株菌的存活率無(wú)顯著差異(P>0.05),具有良好的耐鹽性[23]。

表3 益生菌在不同NaCl質(zhì)量濃度MRS培養(yǎng)基中的存活率Table 3 Survival rates of probiotics in MRS at various concentrations of NaCl
2.1.3 益生菌蛋白水解能力分析
由表4可知,9 株菌中蛋白水解能力最好的4 株菌依次為L(zhǎng). helveticus 1.0612、L. plantarum 1.0320、L. rhamnosus 1.0385和L. acidophilus 1.0357。

表4 益生菌的蛋白水解能力分析Table 4 Analysis of protein hydrolysis degree by probiotics
2.1.4 益生菌抗氧化能力分析

表5 益生菌的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacities of probiotics
由表5可知,DPPH自由基清除率最高的4 株菌依次為L(zhǎng). casei 1.0407、L. rhamnosus 1.0911、L. plantarum 1.0320和L. acidophilus 1.0357,還原能力最好的4 株菌依次為L(zhǎng). rhamnosus 1.0911、L. rhamnosus 1.0205、B. bifidum 07-300B和L. casei 1.0407。
綜上所述,最終確定將水解能力較好的L. helveticus 1.0612和抗氧化性較好的L. rhamnosus 1.0911添加到契達(dá)干酪中。

表6 契達(dá)干酪成分分析Table 6 Analysis of chemical composition of Cheddar cheese
標(biāo)準(zhǔn)契達(dá)干酪組成成分為:蛋白質(zhì)20%~30%,脂肪20%~34%,鹽1%~3%,pH 4.7~5.3。由表6可知,3 組干酪的成分含量均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)組契達(dá)干酪鹽含量顯著高于空白組(P<0.05),可能是由于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制作干酪存在著參數(shù)的不可控性。除鹽分外其他成分均無(wú)顯著性差異,但鹽含量也在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由此而知添加益生菌對(duì)干酪組成成分沒(méi)有顯著影響(P>0.05),可進(jìn)行下一步研究。

圖1 契達(dá)干酪成熟過(guò)程中的活菌數(shù)Fig. 1 Viable counts of Cheddar cheese during ripening period
由圖1可知,3 組干酪在成熟過(guò)程中活菌數(shù)均呈下降趨勢(shì),下降率分別為47.40%、22.18%和21.91%,但益生菌干酪的活菌數(shù)顯著高于空白組(P<0.05),且在成熟末期,兩組益生菌干酪活菌數(shù)均高于7.0(lg(CFU/g)),達(dá)到益生菌食品的菌數(shù)要求,具有益生功能[24]。結(jié)果表明選實(shí)驗(yàn)添加的L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911在干酪中均有良好的存活率。除第0和第3個(gè)月外,兩組益生菌干酪間的活菌數(shù)均無(wú)顯著差異,因此,可排除益生菌菌數(shù)對(duì)干酪抗氧化性的影響。
2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖2 契達(dá)干酪成熟過(guò)程中水溶性提取物的DPPH自由基的清除能力Fig. 2 Scavenging capacity against DPPH radical of water soluble extract (WSE) from Cheddar cheese during ripening period
由圖2可知,3 組干酪在成熟過(guò)程中,DPPH自由基的清除能力均先增大再減小,最后趨于平穩(wěn),并在第4個(gè)月時(shí)達(dá)到最大,分別為44.38%、47.30%和51.05%,且三者間存在顯著差異(P<0.05)。從成熟的0~4 個(gè)月內(nèi),3 組干酪DPPH自由基清除率均顯著升高,并在第5個(gè)月呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05),而在后3 個(gè)月中,每組的DPPH自由基清除率變化不顯著,但添加L. helveticus 1.0612干酪的DPPH自由基清除率顯著高于添加L. rhamnosus 1.0911干酪和空白組(P<0.05)。這是因?yàn)長(zhǎng). helveticus 1.0612的水解能力強(qiáng),增加了酪蛋白的降解,產(chǎn)生了更多具有抗氧化性的肽類(lèi)或氨基酸[25]。Ong等[26]的實(shí)驗(yàn)也表明,乳制品中的生物活性肽含量與種類(lèi)受乳源種類(lèi)、生產(chǎn)技術(shù)和發(fā)酵劑種類(lèi)等因素的影響,因此,干酪的抗氧化性一定程度上取決于蛋白的水解程度和所用的發(fā)酵劑種類(lèi)。干酪成熟期較長(zhǎng),在這一過(guò)程中,蛋白質(zhì)不斷降解,生成具有抗氧化性的短肽,提高了干酪的抗氧化性,而4 個(gè)月后,蛋白降解速度減慢,這些抗氧化肽又被分解成不具有抗氧化性的氨基酸,干酪抗氧化性降低。第7個(gè)月后,小肽的進(jìn)一步生成和水解達(dá)到消長(zhǎng)平衡狀態(tài),使干酪的抗氧化性趨于穩(wěn)定。
2.4.2 羥自由基清除能力

圖3 契達(dá)干酪成熟過(guò)程中水溶性提取物的羥自由基清除率Fig. 3 Scavenging capacity against hydroxyl radical of WSE from Cheddar cheese during ripening period
如圖 3 所示,在前4 個(gè)月的成熟過(guò)程中,3 組契達(dá)干酪的羥自由基清除能力均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加,在第5、6個(gè)月內(nèi)顯著下降(P<0.05),在后3 個(gè)月內(nèi)無(wú)顯著變化。3 組干酪在第4個(gè)月時(shí)羥自由基清除能力達(dá)到最大,分別為43.86%、46.19%和49.97%。在第5~7個(gè)月內(nèi),添加L. helveticus 1.0612干酪的羥自由基清除率顯著高于其他兩組(P<0.05),這是因?yàn)橐嫔尤牒螅勺鳛榭寡趸瘎┡c羥自由基發(fā)生反應(yīng),阻止其與蛋白質(zhì)的結(jié)合,增加蛋白質(zhì)降解生成具有抗氧化性質(zhì)短肽的幾率,從而增加干酪的抗氧化性[27]。
同一干酪水溶提取物對(duì)不同自由基清除能力表現(xiàn)不同,是因?yàn)樽杂苫Y(jié)構(gòu)不同,與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)方式也不同。但兩種方法都表明添加L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911能增強(qiáng)契達(dá)干酪的自由基清除力。因此,添加益生菌可以增加契達(dá)干酪的抗氧化性,相比于益生菌自身抗氧化性而言,菌株的水解能力對(duì)干酪的抗氧化活性影響較大。
2.4.3 還原能力

圖4 契達(dá)干酪成熟過(guò)程中水溶性提取物的還原能力Fig. 4 Reducing power of WSE from Cheddar cheese during ripening period
由圖4可知,3 組干酪還原能力在前5 個(gè)月均顯著增加,在第6、7個(gè)月內(nèi)顯著下降(P<0.05),在最后3 個(gè)月內(nèi)無(wú)顯著變化,并在第5個(gè)月時(shí)達(dá)到最大值。在整個(gè)成熟過(guò)程中,添加益生菌的契達(dá)干酪還原能力顯著高于空白組(0.46)(P<0.05),其中Batch-3(0.66)又顯著高于Batch-2(0.56)(P<0.05),這是因?yàn)楦衫译S著成熟期的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)逐漸降解生成小分子肽和氨基酸等。Farvin等[28]研究結(jié)果表明,大于10 kDa的大分子片段還原能力明顯低于抗壞血酸,而小于3 kDa的低分子物質(zhì)還原能力要高于抗壞血酸,所以分子質(zhì)量越低,還原能力越強(qiáng)。因此,水解能力好的L. helveticus 1.0612能將酪蛋白降解為分子質(zhì)量更小的肽和氨基酸,使得契達(dá)干酪的還原能力提高。

表7 契達(dá)干酪成熟9 個(gè)月后的質(zhì)構(gòu)分析Table 7 Texture properties of Cheddar cheese after 9 months of ripening
由表7可知,空白干酪硬度顯著高于益生菌干酪(P<0.05),這可能是因?yàn)長(zhǎng). helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的加入增加了蛋白的水解程度,使干酪在成熟過(guò)程中產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì),酪蛋白原來(lái)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞,干酪結(jié)構(gòu)變得松散,硬度下降[29]。3 組契達(dá)干酪的膠黏性和咀嚼性無(wú)顯著差異。加入L. rhamnosus 1.0911干酪的彈性與空白組無(wú)顯著差異,但加入L. helveticus 1.0612干酪的彈性顯著高于空白組(P<0.05),這可能是由于菌株特殊的胞內(nèi)酶作用,使干酪原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞[30],分解產(chǎn)生的小物質(zhì)間形成更多的連接鍵,形成更多小的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有利于保持干酪的彈性[31]。

表8 契達(dá)干酪成熟9 個(gè)月后的感官評(píng)分Table 8 Sensory evaluation of Cheddar cheese after 9 months of ripening
由表8可知,添加L. helveticus 1.0612的干酪苦味評(píng)分顯著低于其他兩組(P<0.05),可能是因?yàn)樘砑覮. helveticus 1.0612后增強(qiáng)了酪蛋白的水解程度,產(chǎn)生了具有苦味的氨基酸或短肽,苦味肽的分子質(zhì)量一般較小,且具有疏水性[32],因此苦味肽一定程度上也具有抗氧化性,所以添加L. helveticus 1.0612能增加契達(dá)干酪的抗氧化性,而控制該菌所引起的成熟契達(dá)干酪苦味增強(qiáng)這一問(wèn)題,還有待進(jìn)一步解決。
契達(dá)干酪成熟過(guò)程中,3 組干酪抗氧化能力均先升高、再降低、最后趨于平緩,其中DPPH自由基和羥自由基清除能力均在第4個(gè)月時(shí)達(dá)到最大,還原能力在第5個(gè)月時(shí)達(dá)到最大。L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的添加可顯著提高契達(dá)干酪的抗氧化活性(P<0.05),在契達(dá)干酪中添加水解能力較強(qiáng)的菌株,相比于添加本身具有良好抗氧化活性的菌株,可能會(huì)加劇干酪的蛋白水解,生成具有抗氧化能力的短肽和氨基酸,從而提高干酪的抗氧化活性。通過(guò)對(duì)益生菌干酪質(zhì)構(gòu)、感官的分析得出L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的加入對(duì)契達(dá)干酪的品質(zhì)無(wú)顯著影響,但L. helveticus 1.0612的添加在增加干酪抗氧化活性的同時(shí),會(huì)加劇酪蛋白水解,增加干酪的苦味感。